препарат на основе спор грибов рода Trichoderma spp.
Тетрис — препарат на основе спор грибов рода Trichoderma spp.- Введение
- Свойства грибов рода Trichoderma spp.
- Триходерма в условиях теплиц
- Триходерма и температурный режим
- Состав препарата Тетрис
В статье рассмотрены основные аспекты использования препаратов на основе грибов рода Trichoderma. Проанализировано влияние температуры на рост различных штаммов Trichoderma Представлен принципиально новый препарат Тетрис. Разъяснены основные функции и свойства данного препарата.
Свойства грибов рода Trichoderma spp.
Препараты для растениеводства на основе клеток или спор грибов рода Trichoderma spp. используются в больших количествах не только профессиональными агрономами, но и в личных подсобных и фермерских хозяйствах. Такое широкое применение обусловлено наличием у почвенных грибов этого огромным набором свойств, позволяющих говорить о них как о микроорганизмах полезных для растений. К свойствам, характерным представителям этого рода грибов относится в первую очередь отсутствие фитотоксичности к большинству возделываемых растений, и что важно, это свойство наблюдается даже на стадии возникновения стресса у растения.
Как любой почвенный микроорганизм, эволюционирующий в прикорневой зоне растения, грибы рода Trichoderma spp. способны к росту на органических экссудатах корневой системы растения. Они хорошо растут на сахарах, органических кислотах, аминокислотах, причем с высокой удельной скоростью роста (при планктонном росте) или с высокой радиальной скоростью (при поверхностном росте) и что характерно способны развиваться при низких концентрациях экссудатов корневой системы. Нами были проведены исследования поверхностного культивирования Trichoderma viride на экссудатах корневой системы огурца, показывающие, что данная культура способна расти при концентрациях экссудатов корневой системы порядка 20 мг/л [1]. По данным показателям (скорости роста при минимальных концентрациях компонентов питания) грибы рода Trichoderma либо опережают, либо способны конкурировать с большинством почвенных грибов (в том числе фитопатогенными).
Грибы рода Trichoderma spp. способны к направленному росту в сторону наиболее благоприятную для их развития, это способность сохраняется и при условиях поверхностного культивирования на материалах с разветвленной поверхностью — минеральная вата, кокос, торф. Иными словами, эти грибы способны к росту в сторону корневой системы растения – источника экссудатов.
При достижении корневой системы растения клетки рода Trichoderma spp. способны сорбироваться (прикрепляться) на её поверхности и расти по нему, образуя своего рода пленку из мицелия клеток [2] . Рост может происходить и в объеме, клетки могут образовывать не только моно, но и ди- и три- слои. Концентрация экссудатов в такой системе с сорбированными на поверхности корня микроорганизмами резко снижается, что не позволяет другим клеткам развиваться в области корня занятой клетками гриба рода Trichoderma [3].
Многие представители рода Trichoderma в состоянии сорбции на корневой системе способны к биотрансформации компонентов экссудатов корневой системы растения в соединения стимулирующие метаболические процессы самого растения, в том числе и роста. Таким образом растущие грибы рода Trichoderma могут являться фитостимуляторами.
Общепризнанным является и тот факт, что грибы рода Trichoderma способны к подавлению фитопатогенной микрофлоры не только за счет конкуренции за метаболизируемый субстрат, но и за счет других механизмов. К таким механизмам стоит отнести синтез низкомолекулярных соединений, мембраноторофной природы, способных оказывать отрицательное воздействие на рост иных грибов, включая фитопатогенные [4] .
Ингибирующее воздействие клеток Trichoderma на других обитателей корневого ценоза могут оказывать через образование газовых (легколетучие органические соединения) компонентов метаболизма, эффективность газовых метаболитов в условиях диффузии в почве (субстрате), может быть много выше водорастворимых.
Секреция литических ферментов (включая хитиназы и протеолитические ферменты) клетками Trichoderma, на определенных стадиях развития, позволяет им разрушать клетки фитопатогенной микрофлоры в зоне прямого контакта. Совокупность этих свойств или часть этих свойств, позволяют рассматривать клетки Trichoderma как уникальные микроорганизмы в плане положительного воздействия на развитие растений.
Все эти свойства грибов рода Trichoderma проявляются только при условии роста клеток. Покоящиеся клетки не вступают во взаимодействия с другими клетками различных грибов, в том числе и с фитопатогенными.
Триходерма в условиях теплиц
На рост клеток в прикорневой зоне растения в условиях теплиц оказывают влияние огромное количество факторов, каждый из которых может оказывать существенное влияние. Так, кроме углерод содержащих компонентов, клеткам Trichoderma необходимы минеральные элементы питания. Хорошо, что и растения, и микроорганизмы потребляют азот, фосфор, и минеральные компоненты в одинаковых пропорциях и при одинаковых концентрациях. Внесение удобрений под растения обеспечивает нормальное функционирование и микробного сообщества. Минеральные элементы питания могут еще определять и значение рН почвы. Клетки Trichoderma могут расти в интервале от 4 до 8 единиц значений рН. Этот интервал является приемлемым для многих растений и поддерживается в ходе выращивания растений. Важными параметрами для развития грибов рода Trichoderma spp. являются влажность и растворенный в воде кислород (грибы являются аэробами). При минимальных значениях влажности 35% клетки могут перестать расти и перейти в стадию споруляции. Увеличение влажности при определенных условиях (перелив субстрата) может привести к снижению скорости растворения кислорода в жидкости и как следствие к резкому лимитированию роста клеток Trichoderma.
Триходерма и температурный режим
Важным фактором, определяющим физиологию развития любых микроорганизмов, в том числе и грибов рода Trichoderma является температура. Для многих живых объектов зависимость скорости роста от температуры описывается двумя кривыми — от минимальных значений до оптимальных — кривая Аррениуса, и далее, колоколообразное снижение. Причем, в интервале температур от минимальных до оптимальных микроорганизмы могут находится достаточно долго и колебания температур в этих пределах не приводит к необратимым изменениям их физиологии. А вот даже при однократном переходе границы повышенных температур – могут наступить необратимые изменения в физиологии или даже гибель клеток. Для большинства почвенных микроорганизмов оптимальными температурами являются 25 – 28 0С. Для большинства видов грибов рода Trichodermа sp., оптимум температур наблюдается именно в этом интервале. В реальных условиях развития микробиоты в тепличных комбинатах микроорганизмы могут подвергаться изменению температур в очень широком диапазоне температур в том числе воздействию повышенных температур в летний период времени, когда субстрат и корневая часть растения могут прогреваться до температур выше 40 0С.
1) Исследование роста Trichoderma viride и Fusarium oxysporum на твёрдых микробиологических средах, содержащих экссудаты растений огурца /Шагаев А. А. Марквичев Н.С. //Успехи в химии и химической технологии. – 2016. – Т. 30. – №. 9 (178).
2) Изучение колонизации корневой системы огурца грибом Trichoderma viride / А. С. Журавлёва, А. А. Шагаев, Н.С. Марквичев и др. // Успехи в химии и химической технологии. — 2018. — Т. 32, № 12. — С. 15–17.
3) Поверхностное культивирование грибов рода Fusarium и Trichoderma при непрерывном подводе компонентов питания / Шагаев А. А., Зеленова Н.А., Марквичев Н.С. и др. //Бутлеровские сообщения. – 2017. – Т. 50. – №. 5. – С. 65-72.
4) Dual role of a dedicated GAPDH in the biosynthesis of volatile and non-volatile metabolites-novel insights into the regulation of secondary metabolism in Trichoderma virens/ Bansal R. et al. //Microbiological Research. – 2021. – С. 126862.
Состав препарата Тетрис
Для создания препарата ТЕТРИС были выбраны различные виды грибов рода Trichoderma spp. после проверки способности к поверхностному росту при различных температурах на модели экссудатов корневой системы огурца. Скрининг и отбор проводили среди штаммов микроорганизмов из коллекции штаммов — агентов биологического контроля компании «БИОМ».
Для этого исследовали радиальный рост микроорганизмов на агаризованной среде Чапека с заменой органических компонентов моделью экссудатов корневой системы растения. Для всех исследуемых микроорганизмов проводили культивирование при стабилизации температуры на определенном уровне — 8°C, 14°C, 20 °C, 28 °C, 37 °C, 44 °C. Засев проводили спорами исследуемого штамма, в центр чашки Петри уколом. В ходе экспериментов фиксировали изменение радиуса колонии и далее рассчитывали радиальную скорость роста выбранного штамма. На основании данных по скоростям роста при разных температурах определяли оптимум температуры для каждого конкретного штамма, максимальные и минимальные значения температуры, при которых наблюдался рост.
Во всех экспериментах для всех исследуемых микроорганизмов наблюдали общие закономерности развития микроорганизмов — после лаг фазы наблюдали линейный рост радиуса колонии, по мере приближения к краю чашки Петри скорость развития снижалась. На основе экспериментальных данных для всех микроорганизмов были определены оптимумы температур – интервалы температур, при которых клетки растут с максимальной скоростью, на основе полученных результатов из 6 исследуемых штаммов были выбраны 3, обладающие разными температурными оптимумами. На рис.1 представлены графики зависимости скорости роста от температуры у выбранных микроорганизмов.
Данные микроорганизмы были определены нами как перспективные для препарата ТЕТРИС, наличие 3 видов грибов рода Trichoderma в одном препарате в виде чистых спор позволяет рекомендовать данный препарат для применения в широком интервале температур — от 10 до 40 0С, для внесения через капельный полив под корень. При различной температуре максимальную скорость роста, а соответственно и все сопутствующие этому свойства — будут проявляться у одного из внесенных видов гриба рода Trichoderma. Таким образом препарат ТЕТРИС является более эффективным в сравнении с другими препаратами на основе монокультуры клеток Trichoderma, особенно в период перепадов температур, когда в том числе возможен локальный перегрев матов с субстратом для выращивания растений.
Рисунок 1. Скорость роста грибов рода Trichoderma spp. при культивировании на среде, содержащей модель экссудатов
Сведения об авторах:
Писаревская Виолетта Алексеевна бакалавр кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева
Журавлева Александра Сергеевна магистрант кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева
Минич Мария Владимировна аспирант кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева
Шагаев Антон Александрович аспирант кафедры биотехнологии РХТУ им.
Бехбудзада Нурлан Башир-оглы аспирант кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева
Горюнова Ольга Борисовна генеральный директор ГК «БИОМ»
Марквичев Николай Семенович к.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, заместитель генерального директора ГК «БИОМ»
Следующая статья
Светокультура и болезни растений. Как укрепить слабые стороны передовой технологии.Подпишитесь на рассылку полезных материалов
Будьте в курсе последних новостей и событий, а также узнавайте о наших новых публикациях первыми
ХОРУС® для защиты плодовых деревьев | Сад и огород
ХОРУС® — ХОРОШ в ХОЛОДА от болезней
rgba(255,255,255,0.5)ХОРУС® — высокоэффективный фунгицид с уникальным механизмом действия, созданный для защиты плодовых культур от парши, альтернариоза, мучнистой росы, монилиоза, клястероспориоза, коккомикоза и плодовых гнилей. ХОРУС® обладает системными свойствами и способен проявлять высокую эффективность при пониженных температурах воздуха — от +3 °С. Поэтому ХОРУС® применяют в начале сезона. При температуре воздуха выше +25 °С препарат также отлично справляется с болезнями — имеет высокую стартовую активность и повышенную искореняющую способность. ХОРУС® обладает лечебным и защитным действием. Безопасен для пчел, полезных насекомых и малоопасен для окружающей среды.
Решающий фактор в контроле парши в начале сезона
- Высокоэффективная защита листьев при любой инфекционной нагрузке даже при низких температурах воздуха
- Единственное действующее вещество из данного класса: антирезистентное решение
- Быстрое поглощение растением: не смывается дождем
- Системное, защитное и лечебное действие
- Норма расхода в десятки раз меньше, чем у традиционных контактных препаратов
- Отсутствие фитотоксичности
- Удобная препаративная форма и упаковка
ХОРУС обладает высокой эффективностью при пониженных температурах воздуха — от +3 °С. Поэтому применять ХОРУС на плодовых культурах лучше всего в начале сезона. При повышенных температурах воздуха (выше +25 °С) ХОРУС имеет высокую стартовую активность и повышенную искореняющую способность.
Основная информация
rgb(95,120,0)
Паспорт препарата ХОРУС, ВДГ
add removeРегламент применения для личных подсобных хозяйств
add removeМеханизм действия
add removeПрименение
add removeПриготовление раствора для опрыскивания
add removeПодробнее chevron_right
Подробнее chevron_right
Подробнее chevron_right
Осторожно: подделка!
rgb(95,120,0)
На рынке огромное количество подделок препаратов. Мало того, что фальсификат будут не эффективен, он может быть также и опасен как для вас и ваших питомцев, так и для ваших растений. Внимательно следите за аутентичностью упаковки, покупайте препараты только в проверенных точках продаж, где вы можете быть уверенны в качестве товара.
Оригинальные упаковки продукта ХОРУС® в мелкой фасовке
rgb(95,120,0)
ООО Фирма «Зеленая аптека садовода» ХОРУС® 1г.
ООО Фирма «Зеленая аптека садовода» ХОРУС® 2 г.
ООО «Эксперт Гарден» ХОРУС® 2 г
ООО «Ваше хозяйство» ХОРУС® 3г.
rgba(255,255,255,0.5)
Садоводы и дачники с этим препаратом также используют
rgb(95,120,0)
Для защиты растений различных культур от вредителей в саду и огороде
Органическое удобрение и подкормка корней, листьев на всех культурах
Для защиты плодовых культур, винограда и роз от мучнистой росы
Популярные статьи
rgb(95,120,0)
Нежелательные спутники яблони
Эксперт «Сингенты» Максим Коростиев о качественной защите сада.
Подробнее chevron_right
«Сингента» с заботой о саде
Защитите ваш сад
Подробнее chevron_right
Как правильно защитить яблоню от мучнистой росы?
Верные шаги для защиты сада
Подробнее chevron_right
Полезные видео
rgb(95,120,0)
play_circle
Когда бороться с фитофторой?play_circle
Вебинар: Какие препараты «Сингенты» есть в мелкой фасовке и как отличить подделку?Производство спор папоротника пахучего сена после сплошных рубок
- Данные и инструменты
- Публикации
- Поиск по дереву
- Подземелье
- Библиотека Национальной лесной службы
- Мультимедиа
Авторов: | Кэти А.![]() |
Год: | 1997 |
Тип: | Общий технический отчет |
Станция: | Северная исследовательская станция |
Источник: | В: Палларди, Стивен Г.; Сечич, Роберт А .; Гаррет, Х. Джин; Джонсон, Пол С., ред. Материалы 11-й Центральной конференции по лиственным лесам; Ген. тех. Представитель NC-188. Сент-Пол, Миннесота: Министерство сельского хозяйства США, Лесная служба, Северо-центральная лесная экспериментальная станция: 401 |
Аннотация
Папоротник с запахом сена — распространенный сорняк в подлеске, произрастающий в Аппалачах. Это мешает росту сеянцев дуба и других лиственных пород и часто приводит к сбоям в регенерации. Известно, что сбор урожая увеличивает скорость вегетативного размножения, прорастания спор и, возможно, спорообразования папоротника с запахом сена. Чтобы изучить последний эффект, каждый год с 1990 по 1994 год в смешанном дубовом насаждении в центральной Пенсильвании проводилась последовательная серия из пяти ежегодных сплошных рубок.
Родительская публикация
- Материалы 11-й Центральной конференции лиственных лесов; 1997 23-26 марта; Колумбия, Миссури.
Цитата
Пенрод, Кэти А .; Маккормик, Ларри Х. 1997. Производство спор папоротника с запахом сена после сплошной рубки. В: Палларди, Стивен Г.; Сечич, Роберт А .; Гаррет, Х. Джин; Джонсон, Пол С., ред. Материалы 11-й Центральной конференции по лиственным лесам; Ген. тех. Представитель NC-188. Сент-Пол, Миннесота: Министерство сельского хозяйства США, Лесная служба, Северо-центральная лесная экспериментальная станция: 401.Консервирование изолятов дрожжей и плесени | Грибковые заболевания
Информация о
Сохранение изолятов дрожжей и плесени обеспечивает долгосрочную жизнеспособность. В данной СОП описана процедура сохранения изолятов дрожжей и плесени для хранения.
Стандартная рабочая процедура
PDF-версия pdf icon[PDF – 137 КБ]
- 1.0 Цель
- 2.0 Область применения
- 3.0 Обязанности 900 04
- 4.0 Определения
- 5.0 Оборудование
- 6.0 Реагенты/Среда
- 7.
0 Подготовка реагентов
- 8.0 Принадлежности, другие материалы
- 9.0 Меры предосторожности
- 10.0 Процедура
В этом документе описывается процедура сохранения изолятов дрожжей и плесени для хранения. Сохранение изолятов дрожжей и плесени обеспечивает долгосрочную жизнеспособность.
К началу страницы
2.0 Область применения
В этом документе описаны процедуры, которым необходимо следовать при сохранении изолятов дрожжей и плесени. Используемый метод консервации будет зависеть от морфологии и спорообразования отдельного изолята. Неспорообразующие плесени можно заморозить, но долгосрочная жизнеспособность изолята может значительно снизиться.
К началу страницы
3.0 Обязанности
Позиция | Ответственность |
---|---|
Лаборанты |
|
Начальник лаборатории |
|
К началу страницы
4.

Срок | Определение |
---|---|
САБ Медиа | Агар Сабуро с декстрозой |
СМИ YPSS | Крахмально-дрожжевой агар |
СМИ SCG | Декстрозный агар Сабуро с хлорамфениколом и гентамицином |
ПД | Картофельно-декстрозный агар |
КББ | Шкаф биологической безопасности |
Начало страницы
5.0 Оборудование
5.1
Микроскоп
5.2
9 0018 Шкаф биологической безопасности5.3
Инкубатор
5.4
Морозильная камера -80°C
5,5
Холодильник
К началу страницы
6,0 Реагенты/Среда
6. 1
80 % глицерин-стерильный раствор: (например: MP Biomedical Catalog # 3055-044 или аналогичный). Всегда используйте глицерин с пометкой «для использования в клеточных культурах» или «реагент для молекулярной биологии». Глицерин химической чистоты неприемлем.
6.2
Стерильная вода WFI для клеточных культур
6.3
Декстрозный агар Сабуро ( Emmons) : ( ex: Fisher Scientific Product # L4321849и L21827 или аналогичный).
6.4
Декстрозный агар Сабуро и хлорамфеникол/гентамицин: скошенный ( ex : Fisher Scientific Product #R0876 или аналогичный).
6,5
Агар с овсянкой/Pablum: (всегда используйте смесь злаков, а не чистую овсянку или рисовую муку). Его можно найти в отделе детского питания продуктового магазина.
6,6
Картофельно-декстрозный агар: ( ex : № 213200 по каталогу Becton Dickinson или аналогичный).
6,7
Tween-20: ( ex : Fisher Scientific Product # BP337-100 или аналогичный).
6,8
Лактофенол Хлопок Синий: ( ex : Продукт Fisher Scientific № M1137410100 или аналогичный).
Начало страницы
7.0 Приготовление реагентов
7.1
500 мл раствора 20% глицерина в стерильной воде — Подготовьтесь заранее, чтобы быть готовым к процедурам, описанным ниже.
7.1.1
Добавьте 375 мл стерильной воды качества WFI для клеточных культур в колбу на 1000 мл.
7.1.2
Добавьте 125 мл 80% глицерина в колбу на 1000 мл, содержащую воду.
7.1.3
Перемешивайте раствор, пока ингредиенты не будут тщательно перемешаны.
7.1.4
Профильтруйте раствор в стерильную фильтрующую установку Nalgene с размером пор 0,22.
7.1.5
Пометьте бутылку как 20% Glycerol, укажите дату и имя/инициалы изготовителя и храните при 4°C.
7.2
Овсяно-желтый агар:
7.2.1
Добавьте 25 г смеси сухих злаков (всегда порошок, а не овсянка или рисовая мука. Это можно найти в отделе детского питания продуктового магазина) до 200 мл деионизированной воды.
7.2.2
Добавить 5 г агара.
7.2.3
Доведите конечный объем до 250 мл.
7.2.4
Автоклавируйте в течение 20 минут и разлейте по чашкам Петри. Агар должен быть тонким, примерно 3-5 мм. Должно получиться 10-12 тарелок.
К началу страницы
8.0 Принадлежности, другие материалы
8.1
Стерильные инокуляционные петли 10 мкм
8.2 900 51
Криогенные морозильные камеры
8. 3
15 мл конические пробирки Falcon с синей крышкой
8.4
серологические пипетки 10 мл
8,5 900 74
Предметные стекла
8.6
Покровные стекла любого размера
8.7
Стеклянная колба на 1000 мл
8,8
Чашка Петри с 4 камерами
8,9
Лактофеноловый хлопковый синий или другой краситель
8.10
Стерильные скальпели
8.11
Стерильные ватные тампоны
8.12
Упаковка стерильных игл (18G) 1)
8.13
Фильтр 0,22 мкм
8.14
Криогенный флакон 2 мл пробирки для отцентрифугирования
Начало страницы
9.0 Меры предосторожности
ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении этой стандартной рабочей процедуры необходимо соблюдать все установленные меры безопасности.
9.1
Стандартные средства индивидуальной защиты должны соответствовать установленным правилам, но должны состоять как минимум из халатов, перчаток и защитных очков.
9.2
С образцами следует обращаться так, как если бы они были инфицированы, с использованием безопасных лабораторных процедур, описанных в документе «Биобезопасность в микробиологических и биомедицинских лабораториях», 5-е издание, и в документе CLSI M29-A.
9.3
Тщательно очистите и продезинфицируйте все рабочие поверхности свежеприготовленным раствором Lysol Brand I.C. Четвертичное дезинфицирующее средство, разбавленным 1:128 дистиллированной водой.
9.4
Тщательно вымойте руки после работы с образцами и тестовым реагентом.
9,5
Не объединяйте реагенты из разных партий или из разных бутылей одной партии.
9.6
Утилизируйте неиспользованные реагенты и отходы в соответствии с федеральными, государственными, местными и институциональными нормами.
Начало страницы
10.0 Процедура
10.1
Замораживание изолятов дрожжей
Ступенька | Действие |
---|---|
1 | Достаньте свежую чашку с агаром SCG или скошенную из холодильника при 4°C и поместите на стол. Всегда давайте тарелке или наклонной пластине нагреться до комнатной температуры. |
2 | Посейте штрихом чашку или скошенный SCG, взяв легкий инокулят из культуры дрожжей, подлежащей хранению, и инокулируйте свежую чашку. |
3 | Инкубируйте засеянный планшет в течение 48 часов при 30°C. Культура должна находиться в средней или поздней логарифмической фазе роста. При необходимости отрегулируйте время инкубации, пока не появятся колонии размером 2–3 мм. |
4 | Проверьте изолят под микроскопом, чтобы убедиться, что он свободен от бактериального загрязнения.![]() |
5 | Следующие шаги должны быть выполнены в БББ для обеспечения стерильности. |
6 | Подготовьте криогенные флаконы с завинчивающимися крышками, пометьте дату и идентификационное название/номер изолята. По возможности используйте печатную этикетку. Напечатанные этикетки должны быть достаточно прочными, чтобы выдерживать температуру -80°C без разрушения. Почерк должен быть разборчивым, а чернила должны выдерживать температуру -80°C. |
7 | Добавьте в каждый флакон 1,5 мл стерильного 20% глицерина. |
8 | Сделайте тяжелую суспензию дрожжевого роста с помощью стерильной инокуляционной петли или ватного тампона, эмульгировав дрожжевой рост в каждом флаконе. Закрепите крышку и вихрь в течение 5 сек. |
9 | Храните флаконы при температуре -70°C или в зависимости от условий вашей лаборатории.![]() |
10.2
Альтернативный метод: замораживание изолятов дрожжей
Ступенька | Действие |
---|---|
1 | Выполните шаги с 1 по 4 в методе заморозки 10.1. |
2 | Следующие шаги должны быть выполняли в BSC для обеспечения стерильности. |
3 | Подготовьте криогенные флаконы с завинчивающимися крышками, пометьте дату и идентификационное название/номер изолята. По возможности используйте печатную этикетку. Этикетки должны быть достаточно прочными, чтобы выдерживать температуру -80°C без разрушения. Почерк должен быть разборчивым, а чернила должны выдерживать температуру -80°C. |
4 | Соблюдая правила асептики, пипеткой перенесите 9 мл стерильного 20% раствора глицерина в стерильную градуированную коническую пробирку объемом 15 мл.![]() |
5 | Сделайте тяжелую суспензию дрожжевого роста с помощью стерильной инокуляционной петли или ватного тампона, эмульгировав дрожжевой рост (примерно 5 колоний) в градуированную пробирку объемом 15 мл. Закрепите крышку и вихрь в течение 5 сек. |
6 | Используя стерильную пипетку для переноса, перенесите примерно 1,5 мл суспензии дрожжей в каждый криогенный флакон. |
7 | Храните флаконы при температуре -70°C или в зависимости от условий вашей лаборатории. |
Примечание. Метод, описанный ниже в разделе 11.1, также можно использовать для изолятов дрожжей.
11.1
Замораживание плесневых изолятов с сильным спорообразованием
Ступенька | Действие |
---|---|
1 | Достаньте свежую скошенную твердую среду (SA, PD и т.![]() Примечание: Различные группы организмов лучше спорообразуют на разных типах сред (см. Таблицу A ниже) |
2 | Убедитесь, что 20% глицерина достаточно для количества изолятов, которые необходимо заморозить. Если нет, перейдите к шагу 7.1. |
3 | Поместите форму для консервации в БББ. |
4 | Инокулируйте свежий скошенный материал и поместите в инкубатор при 25°C. Примечание: Есть несколько плесеней, которым для производства спор требуется другая температура. |
5 | Инкубируйте скошенный в течение не менее 7 дней или до тех пор, пока под микроскопом не будет наблюдаться роскошное конидиальное образование. Медленно растущим организмам может потребоваться более длительная инкубация.![]() |
6 | Выполните пробную подготовку скошенного края, чтобы подтвердить образование спор. Убедитесь, что культура не загрязнена бактериями. |
7 | Примечание: Рассмотрите культуру под микроскопом и найдите образование спор/конидий. Если спорообразование не происходит, обратитесь к процедуре для селективной среды для спорообразования (раздел 11.3). |
8 |
|
11,2
Таблица А. Рецепты этих сред при необходимости можно найти в учебниках по грибкам.
Организм | Среда для спорообразования | Альтернативная среда для спорообразования |
---|---|---|
Дерматофиты | Паблум | Леониан |
Aspergillus/Penicillium spp.![]() | Чапек | Солод |
Мукормицеты | КПК | Водопроводная вода |
Черные формы | Паблум | В-8 |
Fusarium sp. | КПК | Картофель-морковь |
Coccidioides sp. | ИПСС | Паблум |
ПРИМЕЧАНИЕ. Скошенные культуры следует инкубировать при 25°C и периодически проверять (два раза в неделю) в течение 2 недель. Некоторым организмам потребуется более длительная инкубация или инкубация при 37°C в зависимости от вида.
11.3
Плесень для замораживания Изоляты с плохим спорообразованием (должны работать в БББ)
Ступенька | Действие |
---|---|
1 | Достаньте свежую чашку с твердой средой (см.![]() |
2 | Убедитесь, что 20% глицерина достаточно для количества изолятов, которые необходимо заморозить. Если нет, перейдите к шагу 7.1. |
3 | Поместите форму для консервации в БББ. |
4 | Засейте свежую чашку и поместите в инкубатор при 25°C. Примечание: Есть несколько плесеней, которым для производства спор требуется другая температура. |
5 | Держите пластину не менее 7 дней. Медленно растущим организмам может потребоваться более длительная инкубация. |
6 | Примечание: Для очень медленно растущего изолята может потребоваться инокуляция нескольких чашек. |
7 | Выполните предварительную подготовку колонии к поиску споропродукции.![]() |
8 | Примечание: Производство спор может быть скудным; путем сбора больших участков грибкового нароста, которые могут содержать некоторые из немногих редких спор, можно использовать чашки со скудным образованием спор. |
9 |
|
11.4
Консервация плесени в воде (должна выполняться в БББ)
Ступенька | Действие |
---|---|
1 | Выращивайте организмы в подходящей среде для спорообразования. (см. Таблицу А). |
2 | Проверка на спорообразование и чистоту в соответствии с вышеуказанными процедурами (11.3) |
3 |
|
11.5
Консервирование мукормицетов и дематиевых организмов в воде (должно выполняться в БББ)
Ступенька | Действие |
---|---|
1 |
|
2 | После роста проверьте спорообразование и чистоту, удалив небольшую колонию и подготовив пробу. |
3 |
|