Как размножить кислицу комнатную — Всё о цветах

Лучшие советы по выращиванию кислицы

Кислица или оксалис (от лат. Oxalis – “кислый”) принадлежит роду травянистых однолетних и многолетних растений семейства Кисличных. Его выращивают и на открытом воздухе, но особый интерес кислица представляет именно в домашних условиях. Она отлично смотрится в качестве декора, благодаря не только красивым цветкам, но и необычным, изысканным листьям. Оксалис (кислица) радует своих владельцев приятным ароматом цветов.

Какие условия нужны в доме для выращивания кислицы

Оксалис является выходцем из жарких стран, что уже само по себе говорит о некоторых факторах, которые необходимо учитывать при его выращивании у себя дома.

Место в доме и освещение

Это растение требует хорошего освещения. По возможности стоит размещать вазон с кустом в западной или южной части помещения. Если цветок будет расти на северной стороне, то может потребоваться дополнительный источник света. Оксалис обычно высаживают в цветочный горшок, иногда в кашпо. В летнее время его также можно пересадить на садовый участок.

Температурный режим: лето-зима

Летом кислица лучше всего себя чувствует, когда температура варьируется от + 20 до +25°. При наступлении холодов цветок переходит в стадию покоя, поэтому для кислицы в это время температура должна находиться в пределах +14-+18 °.

Как ухаживать за кислицей в домашних условиях

Соблюдать вышеперечисленные условия не трудно, далее рассмотрим основные моменты при уходе за кислицей. Хоть она и любит яркий свет, учтите, что прямые солнечные лучи могут обжечь листья, оставив при этом ожоги в виде бурых и желтоватых пятен. Помимо этого, растение необходимо правильно поливать и своевременно подкармливать.

Полив и влажность воздуха

Кислица домашняя любит влагу. Если у вас в квартире жарко, то цветок следует ежедневно опрыскивать водой комнатной температуры, а поливать как минимум 2-3 раза в неделю. После наступления холодов полив необходимо ограничить, чтобы почва оставалась слегка влажной, а опрыскивания нужно исключить.

Возобновлять полив либо увеличивать его интенсивность следует, когда у растения начинают показываться молодые побеги. После этого также рекомендуется перенести растение в более теплое помещение, если есть такая возможность.

Подкормка растения

Оксалис необходимо удобрять с апреля по сентябрь (во время фазы активного роста и цветения). Достаточно будет делать это раз в 2-3 недели. Лучше всего подходят минеральные удобрения, желательно комплексные. Опытные садоводы при этом настоятельно рекомендуют использовать концентрацию раствора в 2 раза слабее, чем указано производителем в инструкции.

Как правильно пересадить кислицу в новый горшок

Пересаживают кислицу ежегодно. После периода покоя необходимо сажать не по одной, а по несколько луковичек либо клубеньков, с обязательным добавлением дренажа. Цветочный горшок для кислицы лучше брать пошире. Субстрат, емкость и дренаж должны быть новые.

Если растению оказывали должный уход, то за год оно хорошо разрастается и приобретает вид пышного куста. При этом пересадка кислицы становится обязательным ритуалом при выращивании в домашних условиях. Новый горшок лучше брать побольше, если не планируется деление или удаление части растения. Если же часть вы планируете удалить, то размер емкости можно не менять.

Заполняем новый сосуд дренажем (примерно на треть). Это должно обеспечить отвод воды и позволит избежать проблем, связанных с избыточным поливом. После этого засыпаем субстрат. Его можно купить в любом магазине цветов либо приготовить самостоятельно. Для этого нужно взять в равных частях речной песок, торф, листовую землю и перегной. Помимо этого, опытные садоводы рекомендуют добавить в субстрат немного кокосовой стружки. Хороший грунт очень важен для кислицы.

В тоже время очень важно не переусердствовать с удобрениями. От качества почвы и соотношения компонентов зависит развитие растения. В случае с кислицей треугольной, избыток питательных веществ пойдет на пользу только лиственной массе в ущерб пышному цветению.

Как размножается кислица

Размножение также является важным аспектом выращивания оксалиса. Способов размножения много, но в домашних условиях наиболее часто кислицу размножают с помощью клубней, луковиц, черенков или листьев. Рассмотрим подробнее каждый из них.

Клубнями и луковицами

Поскольку эти 2 метода по сути своей идентичны, их можно рассматривать вместе. Луковицы либо клубни нужно искать около старого корневища, вырастают они именно там. Их сажают группами по 5–10 луковичек (клубеньков), а сверху немного присыпают почвой. Высаженная таким образом кислица достаточно быстро растет и развивается. Пройдет всего 4 недели, и у вас появится полноценное растение, выращенное своими руками.

Черенками

Для этого способа нам необходимо заготовить черенки, срезав побеги с уже взрослого растения. Их нужно поместить в емкость с водой, чтобы получить первые отростки потребуется 2-3 недели. Когда их длина достигнет 1,5 см, для продолжения развития растения, черенки необходимо пересадить. Горшки с грунтом подготовить нужно заранее. На фото (см. ниже) можно увидеть только что пересаженные молодые черенки.

Листьями

В качестве черенка можно использовать и обычный лист. Укоренение лучше проводить весной. Нужно отрезать листик, стебелёк которого должен быть примерно 10 см длиной. Поступаем с ним таким же образом, как и с черенком – помещаем в емкость с водой.

Через время на срезе появятся тонюсенькие корешки. На этом этапе нужно не спешить, подождать пока они станут длиннее и окрепнут, а только затем аккуратно посадить в землю.

Болезни и вредители растения: лечение и уход в этот период

В домашних условиях кислица болеет крайне редко, а поражается вредителями еще реже. Болезни могут возникать после нападений на растение щитовки, тли, белокрылки, червеца, клещей. Устраняются вредители с помощью препаратов, которые продаются в цветочных магазинах, однако если растениям оказан надлежащий уход, появление паразитов не должно вас волновать.

Растение могут поразить фузариоз, а также серая гниль. Это происходит, если переусердствовать с поливом, а также при отсутствии хорошего слоя дренажа. Для лечения этих заболеваний в начальной стадии используется “Фундазол”.

Выращивание оксалиса полно своих нюансов и особенностей, и требует тщательного ухода в домашних условиях. Но если соблюдать простые рекомендации и как следует ухаживать за растением, этот процесс принесет в ваш дом лишь радость и красоту.

Цветок кислица: уход в домашних условиях

Кислица принадлежит к травянистым растениям. В народе ее называют заячьей капустой или ложным клевером. В естественных условиях трава растет в Мексике и Южной Африке. Уникальные декоративные свойства служат поводом использования кислицы в ландшафтном дизайне. Траву высаживают на альпийских горках, вдоль бордюров.

Кислица в домашних условиях применяется не только как украшение подоконников, но и с лечебными целями. Ее полезные свойства распространяются на заболевания желчного пузыря, печени, поджелудочной железы, почек и мочевыводящей системы. Кислица домашняя имеет научное название окласис.

Многообразие видов

В природе произрастает более 80 видов кислицы. Среди окультуренных для выращивания в домашних условиях известно около 20 разновидностей кислицы.

Каждый сорт растения обладает своими индивидуальными внешними характеристиками, виды отличаются между собой по срокам и продолжительности цветения.

Кислица обыкновенная

Данная разновидность кислицы активнее всего растет в хвойных лесах, на болотистых участках. Некоторые из экземпляров вырастают до 10-12 см в высоту. Корневище тонкое ползучее, на некоторых кустах формируются отличительные вздутия. Листовые пластины располагаются на тонких побегах, имеют треугольную напоминающую сердце форму.

Побеги и цветы зеленого или яркого салатового цвета. В растение обнаружено высокое содержание аскорбиновой и щавелевой кислоты, на вкус листья кислые. При выбросе бутонов в первой половине лета появляются одиночные цветы белого оттенка.

Они характеризуются закругленными краями с красными или сиреневыми прожилками. Эта разновидность кислицы в домашних условиях приживается очень редко. Однако некоторые цветоводы высаживают цветок в кашпо и вазоны из-за витаминного состава и высокого содержания аскорбиновой кислоты.

Кислица Фиолетовая

Этот цветок относится к теплолюбивым видам. Растение окультурено для выращивания в комнатных условиях, отличается большими пурпурно-фиолетовыми листьями. На верхних частях побегов располагается по три пластины с угловатыми окончаниями.

При цветении растение выбрасывает по несколько розовых бутонов на тонких цветоносах. Цветок оксалиса (кислицы) распускается обычно в июне. При хороших подкормках и дополнительном освещении может зацветать повторно.

Кислица Пестроцветная

Эта разновидность растения, считается одной из самых оригинальных кислиц комнатных. Компактный кустик высотой до 15 см, шириной до 25 см имеет множество тонкий стебель с сочными зелеными узкими листочками.

Цветок кислицы Пестроцветной представляет собой цилиндрическую трубочку с белыми и бордовыми полосками. С наступлением ночи все соцветия скручиваются в узкие трубочки, а утром снова выпрямляются.

Кислица Четырехлистная

Растение является многолетником и размножается преимущественно луковицами. В естественных условиях произрастает в Мексике и Панаме. При выращивании в комнате достигает в высоту 15 см.

Из черной луковицы выходят тонкие укороченные стебли. Соцветия образуются внутри розетки с 3-6 черешковыми листьями. По краям они зеленые в центре с темно-коричневыми пятнами.

Зацветает кислица Четырехлистная в период с июня по сентябрь. Бутоны имеют зонтичную форму и насыщенный красный оттенок. У основания цветки окрашены в желтый тон.

Диаметр цветков может достигать от 2 до 4 см. Эксперты отмечают, что в кашпо небольшого размера цветение более продолжительное, но сами цветки мелкие. Если посадить кислицу в большой горшок, то цветки порадуют крупными размерами.

Особенности выращивания кислицы

Растение кислица в домашних условиях размножается посредством семян, клубней или черенков.

Размножение домашнего цветка кислица семенами

Лучшее время размножения семенами – весна.

1. Сеять их нужно в небольшие контейнеры или торфяные горшочки. В специальный грунт для комнатных растений, на глубину до 3 мм слегка присыпав землей.
2. Поливать нужно с распрыскивателя по мере пересыхания верхнего слоя.
3. Первые всходы появляются через 10-14 дней.
4. В течение первых 12 месяцев у молодых саженцев формируются розетки, образуется корневая система. Пересаживать в другое кашпо кислицу не рекомендуется в течение первого года. Даже плотные на первый взгляд кустки могут оказаться слишком чувствительными для транспортировки в другую емкость и не приживутся.
5. На следующую осень у окрепших растений отмирает верхняя часть, клубни рекомендуется выкапывать из почвы. Их содержать до весны в затемненном прохладном помещении.
6. Взрослые экземпляры высаживаются в рыхлую садовую землю, перемешанную с речным песком. В кашпо диаметром 30-40 см допускается высаживать до 10 клубней кислицы.

Верхний слой почвы не должен превышать 1 см, иначе ростки начнут загнивать и растение погибнет. Первые 2-4 недели растения содержат при температуре от +5 до +10°C.

Полив необходим умеренный. Высаживать таким способом кислицу можно в течение всего года. По истечении 2-2,5 месяцев кустки становятся пышными, при оптимальном освещении начинают быстро зацветать.

Размножение черенками

Для укоренения цветка с помощью черенков, можно срезать любые зеленые части. Хорошо приживаются листья кислицы с черешком, цветоносы с цветами.

Ждать пока появятся первые корешки, можно оставив их в емкости с водой или сразу посадив почву. Земля должна включать речной песок, перегной листовой, одну часть дерновой земли. Приживаемость длится при +25°C в течение 3 недель.

Как ухаживать за цветком кислица

Кислица уход в домашних условиях не требует особенный. Главное придерживаться всех рекомендаций, соблюдать режим оптимального светового дня и увлажнения почвы.

Для благоприятного роста и развития кислицы требуется соблюдать состав земли из смеси речного песка, перегноя, торфа, листового дерна. На дно необходимо укладывать небольшой дренажный слой с цветочным керамзитом или мелким гравием.

Освещение

Быстрому росту и обильному цветению способствует соблюдение светового дня до 14 часов. В жаркие летние дни вазоны с кислицей нужно затенять.

В осенне-зимний период кислица требует усиленный уход в плане освещения. Для этого применяют фито-лампы. При игнорировании этих рекомендаций растения мельчают, листья вянут, а цветение не наступает.

Температура

Лучший температурный режим для кислицы от +20 до +25°C. Необходимо регулярно проветривать комнату, если температура выше этой нормы.

Сквозняков кислица тоже не переносит, некоторые цветоводы предпочитают на летние месяцы выносить цветы на балкон или лоджию. Однако стоит оберегать цветы от палящего солнца.

В зимние месяцы, чтобы растение зацвело своевременно, его содержать не выше +18°C. Большинство видов в этот период находятся в состоянии покоя и в дополнительном освещении, высоких температурах не нуждаются.

За 2-3 недели перед наступлением весны кашпо помещают в более теплое место для активизации роста.

Влажность и полив

Эксперты по цветоводству советуют не поливать часто землю в кашпо с кислицей, исключение составляет период интенсивного роста.

Переувлажнение почвы может негативно сказаться на формировании новых побегов и цветении. Цветок предпочитает опрыскивания и отлично переносит переувлажнение воздуха в комнате.

С октября рекомендуется постепенно сокращать поливы. Когда растение находится в состоянии покоя, после отмирания наземной части, в течение 2 месяцев оно вообще не нуждается в воде. В периоды включенного центрального отопления лучше ставить увлажнитель воздуха или емкости с водой.

Подкормки

С началом весны и на протяжении всего сезона кислица нуждается в дополнительном питании. Для этого применяют жидкие минеральные добавки для комнатных цветов. Вносить их необходимо в соответствии с инструкцией по применению, желательно каждые 3 недели и обязательно после полива.

Вредители и болезни

Оксалис достаточно редко подвергается заболеваниям цветочных культур. В исключительных случаях, при обильном порыве и низких температурах развивается серая гниль или мучнистая роса.

Поражение вредителями (мучнистый червец, паутинные клещи) так же бывает редко. Повышенное содержание кислоты в побегах и корневище цветка способствует стойкому иммунитету. При необходимости растения обрабатывают специальными препаратами для комнатных культур.

Интересные факты о кислице

1. Комнатная кислица с давних времен применяется в народной медицине. Высокое содержание аскорбиновой, янтарной, щавелевой кислоты делают растение особенно популярным для лечения проблем с пищеварением, снижения спазмов при менструальных болях, как жаропонижающее средство.
2. Побеги и цветки окласиса используют для заживления ран и гнойных воспалений. Из зеленой массы делают кашицу и прикладывают к пораженному участку на 3-4 час в день. Воспаление снижается уже после первого нанесения. Высушенное сырье добавляют в пищу, в чай это помогает справиться с желудочными коликами, устраняет запоры и диарею.
3. Существует примета, что посаженная кислица в доме символизирует благополучие и мир в семье. Согласно народным поверьям она обладает особой энергетикой, предотвращает ссоры и размолвки. Говорят, что дом будут часто навещать друзья. Кислица является оберегом от сглаза и негативной энергетики. С этими целями ее рекомендуют размещать на полках около входных дверей, на террасе или лестничной клетке.
4. Если кислицу посадит одинокий человек, в скором времени он найдет себе пару и станет счастливым. Растение избавляет от депрессии и апатии, улучшает сон, придает энергии. На Востоке окласис принято преподносить на рождество и Новый год, в качестве пожеланий удачи, благополучия и финансовой стабильности хозяевам.

Кислица уход в домашних условиях полив пересадка и размножение

Кислица (Oxalis) — это род травянистых растений, принадлежащий к семье Кисличных. Эта трава широко распространена почти на всех континентах и даже является символом Ирландии. Такое название растение получило из-за кисловатого вкуса листвы; в переводе с латыни Oxalis тоже значит кислый. У нас же этот цветок прозван «заячья капуста».

Содержание

Общие сведения

Диких видов кислицы существует около восьми сотен, а среди окультуренных есть и садовые и комнатные типы.

Кислицы сложно охарактеризовать одним словом, так как в пределах рода есть и однолетники, и многолетние растения, травы с клубневым корневищем и с луковицами. Листва этих цветов размещается на черешке, она пальчатая или тройчатая. Интересной особенностью является то, что вечером она сгибается, а на утро раскрывается.

Окраска листвы зависит от вида и бывает зеленой, бордовой либо фиолетовой. Цветы небольшие, правильные, в основном нежных тонов. Вечером, а также перед непогодой, цветы закрываются.

Семечки созревают в плоде, который легко лопается, когда к нему прикасаются. Помимо этого трава используется в приготовлении блюд – ее добавляют в первые блюда, чаи, квас. В культуре чаще всего выращиваются кислица треугольная и четырехлистная.

Виды и сорта

Кислица треугольная или же фиолетовая самый распространенный в культуре вид. Это невысокий цветок с пурпурной листвой. Цветы маленькие, обычно белые или нежно-розовые.

Кислица четырехлистная или Деппе может выращиваться и в саду и в комнатных условиях. Ее листья имеют по 4 доли нежно-зеленого цвета с бордовой срединой. Соцветия алой окраски. Этот вид в Европе назван «счастливый клевер»

Кислица обыкновенная представляет собой низкий кустик с похожей на клевер листвой и крупными одиночными цветами.

Кислица Боуви нежный цветок, который очень боится холодов. Имеет светлые листья и нежно-сиреневые цветы.

Кислица разноцветная очень красивый вид, получивший популярность благодаря белым цветам с алыми полосами.

Также известными являются кислица клубненосная, рожковая, бедная, суккулентная, но они не особо популярны и довольно редко выращиваются.

Кислица уход в домашних условиях

Комнатной кислице нужны такие же условия, как и дикой. Первым условием здоровья растения является яркое, но рассеянное освещение, так чтобы прямые лучи его не касались.

Летняя температура походящая для кислицы колеблется около 25°С, а зимняя в районе 12-18°С.

Полив кислицы комнатной

Кислице нужно много влаги, но следите за сыростью почву, ведь если вода будет надолго оставаться в горшке, корни могут загнить. С приходом осени поливать цветок начинают реже, а в зимний период полив производят только для легкого увлажнения грунта.

Опрыскивать цветок в основном не нужно, но в случае слишком знойной погоды можно это делать, используя кипяченую воду. Зимой выполнять эту процедуру нельзя.

Кислица период покоя

Некоторые виды на зиму впадают в период покоя, который продолжается около полутора месяца. Если после цветения с растения начала падать листва, то уменьшите полив и поместите кислицу в прохладной комнате, где она пробудет до окончания периода покоя.

Бывает что листва остается на растении, но оно останавливается в росте: это тоже свидетельствует об потребности перемещения в более прохладное место на отдых.

Что период покоя закончился, вы узнаете по появлению новых веточек. Когда это случится, пересадите цветок и ухаживайте за ним как прежде.

Удобрение для кислицы

Чтобы растение хорошо росло, ему нужны подкормки. Для этого во время активного роста каждые 15-20 дней вносятся комплексные минеральные удобрения, но с учетом, что разводить их нужно в два раза больше чем указано в инструкции.

Пересадка кислицы в домашних условиях

Выращивая кислицу, молодые растения нужно каждый год пересаживать. Для взрослых цветов эту процедуру проводят раз на пару лет.

Выбирая емкость для посадки, обратите внимание на широкие горшки, в которые можно вместить не один клубень или луковицу. Это нужно чтобы растение образовало кустик, а не росло одиноко.

В емкости для посадки обязательно нужно разместить дренажный слой. В плане субстрата кислица неприхотлива, и вы можете просто купить универсальную почву в магазине. Главное помните, что в слишком питательной земле растение не зацветет.

Пересаживать кустик нужно крайне осторожно, это делают вместе с почвой, чтобы сохранить в целости корневище (за исключением случаев, когда вы хотите ее в этом году размножать).

Кислица размножение семенами

В природе кислица размножается самосевом, но при разведении ее дома, к этому способу обычно не обращаются, из-за наличия более простых и надежных. Но если хотите, то можете попробовать вырастить цветочек семенным способом.

Для этого нужно подготовить субстрат из лиственного перегноя, торфа и песка (4:4:1). Посеять поверх субстрата семена, не укрывая их. После этого контейнер прикрывают стеклом, для образования тепличных условий.

Чтобы семечки проросли, кроме высокой влажности им нужны рассеянное освещение и температура близкая к 17°С. Также не забывайте каждый день проветривать посев и опрыскивать его водой.

В зависимости от того какого возраста семена, на промежутке от 7 до 30 дней вы получите всходы.

Размножение кислицы дочерними луковицами

Легче всего размножить кислицу, отделив от главного корня, дочерние образования. Далее материал просто рассаживают, размещая в одном горшке по несколько корешков или луковиц, и немного присыпают почвой. После этого контейнер размещают в слабо освещаемом, прохладном месте, иногда поливая грунт.

Когда проклюнутся ростки, горшок переносят на свет. А через 30-40 дней у вас уже будет молодой свежий куст.

Кислица размножение делением корневища

Деление корня тоже довольно простой способ. По окончании периода покоя, когда растение выгонит молодой лист, корневище нужно вытащить из почвы, очистить и обработать легким раствором марганца. После этого его делят на части, припудривают надрезы древесным углем и высаживают в отдельные контейнеры.

Емкости с посаженным ставят под рассеянным освещением и поливают по мере высыхания почвы. А с 15 дня после посадки начинают удобрять два раза на 30 дней.

Кислица размножение листом

Также можно размножить цветок листом. Чтобы это сделать выбирайте растение не меньше 10 см высотой и минимум с тремя листьями.

Листок просто отрезается и помещается в воду. Со временем появятся корни, когда они станут больше, просто черенок посадите в почву. Поливайте молодой цветочек, и скоро он начнет выгонять новые листики.

Болезни и вредители

В целом кислица не боится болезней и вредителей, но если неправильно за ней ухаживать, то возможен и такой исход:

• Чаще всего на растение нападают паутинный клещ, тля и щитовка. Против клеща борются актелликом, тлю уничтожают раствором мыла или водой с мандариновыми корками, от щитовки избавляются актарой.
• При излишке влаги, кислица может заболеть серой гнилью или фузариозом. От обеих хворей избавляются с помощью фундазола.
• Если ваша кислица не открывает листья, то, скорее всего, проблема в уходе. Чаще всего такое происходит из-за пересыхания почвы или при слишком сухом воздухе.
• Вянуть кислица чаще всего начинает при избытке влаги, а также при истощении грунта. Если увядание происходит на зиму и после этого она сбрасывает листья, то это подготовка к периоду покоя.
• Бывает, что у кислицы сохнут листья. Обычно это связано с тем, что ее размещают на солнце и листва получает ожоги. Также подобное случается из-за сухого воздуха и слишком высокой температуры.
• Помимо этого листья могут сохнуть потому, что купленное растение еще не привыкло к новым условиям, нужно просто подождать пока оно акклиматизируется.

Понравилась статья! Оцените её в рейтинге.

Возникли вопросы в выращивании! Напишите в комментариях.

{SOURCE}

Кислица уход в домашних условиях полив пересадка и размножение

Кислица (Oxalis) – это род травянистых растений, принадлежащий к семье Кисличных. Эта трава широко распространена почти на всех континентах и даже является символом Ирландии. Такое название растение получило из-за кисловатого вкуса листвы; в переводе с латыни Oxalis тоже значит кислый. У нас же этот цветок прозван «заячья капуста».

Общие сведения

Диких видов кислицы существует около восьми сотен, а среди окультуренных есть и садовые и комнатные типы.

Кислицы сложно охарактеризовать одним словом, так как в пределах рода есть и однолетники, и многолетние растения, травы с клубневым корневищем и с луковицами. Листва этих цветов размещается на черешке, она пальчатая или тройчатая. Интересной особенностью является то, что вечером она сгибается, а на утро раскрывается.

Окраска листвы зависит от вида и бывает зеленой, бордовой либо фиолетовой.  Цветы небольшие, правильные, в основном нежных тонов. Вечером, а также перед непогодой, цветы закрываются.

Семечки созревают в плоде, который легко лопается, когда к нему прикасаются. Помимо этого трава используется в приготовлении блюд – ее добавляют в первые блюда, чаи, квас. В культуре чаще всего выращиваются кислица треугольная и четырехлистная.

Виды и сорта

Кислица треугольная или же фиолетовая самый распространенный в культуре вид. Это невысокий цветок с пурпурной листвой. Цветы маленькие, обычно белые или нежно-розовые.

Кислица четырехлистная или Деппе может выращиваться и в саду и в комнатных условиях. Ее листья имеют по 4 доли нежно-зеленого цвета с бордовой срединой. Соцветия алой окраски. Этот вид в Европе назван «счастливый клевер»

Кислица обыкновенная представляет собой низкий кустик с похожей на клевер листвой и крупными одиночными цветами.

Кислица Боуви нежный цветок, который очень боится холодов. Имеет светлые листья и нежно-сиреневые цветы.

Кислица разноцветная очень красивый вид, получивший популярность благодаря белым цветам с алыми полосами.

Также известными являются кислица клубненосная, рожковая, бедная, суккулентная, но они не особо популярны и довольно редко выращиваются.

Кислица уход в домашних условиях

Комнатной кислице нужны такие же условия, как и дикой. Первым условием здоровья растения является яркое, но рассеянное освещение, так чтобы прямые лучи его не касались.

Летняя температура походящая для кислицы колеблется около 25°С, а зимняя в районе 12-18°С.

Полив кислицы комнатной

Кислице нужно много влаги, но следите за сыростью почву, ведь если вода будет надолго оставаться в горшке, корни могут загнить. С приходом осени поливать цветок начинают реже, а в зимний период полив производят только для легкого увлажнения грунта.

Опрыскивать цветок в основном не нужно, но в случае слишком знойной погоды можно это делать, используя кипяченую воду. Зимой выполнять эту процедуру нельзя.

Кислица период покоя

Некоторые виды на зиму впадают в период покоя, который продолжается около полутора месяца. Если после цветения с растения начала падать листва, то уменьшите полив и поместите кислицу в прохладной комнате, где она пробудет до окончания периода покоя.

Бывает что листва остается на растении, но оно останавливается в росте: это тоже свидетельствует об потребности перемещения в более прохладное место на отдых.

Что период покоя закончился, вы узнаете по появлению новых веточек. Когда это случится, пересадите цветок и ухаживайте за ним как прежде.

Удобрение для кислицы

Чтобы растение хорошо росло, ему нужны подкормки. Для этого во время активного роста каждые 15-20 дней вносятся комплексные минеральные удобрения, но с учетом, что разводить их нужно в два раза больше чем указано в инструкции.

Пересадка кислицы в домашних условиях

Выращивая кислицу, молодые растения нужно каждый год пересаживать. Для взрослых цветов эту процедуру проводят раз на пару лет.

Выбирая емкость для посадки, обратите внимание на широкие горшки, в которые можно вместить не один клубень или луковицу. Это нужно чтобы растение образовало кустик, а не росло одиноко.

В емкости для посадки обязательно нужно разместить дренажный слой. В плане субстрата кислица неприхотлива, и вы можете просто купить универсальную почву в магазине. Главное помните, что в слишком питательной земле растение не зацветет.

Пересаживать кустик нужно крайне осторожно, это делают вместе с почвой, чтобы сохранить в целости корневище (за исключением случаев, когда вы хотите ее в этом году размножать).

Кислица размножение семенами

В природе кислица размножается самосевом, но при разведении ее дома, к этому способу обычно не обращаются, из-за наличия  более простых и надежных.  Но если хотите, то можете попробовать вырастить цветочек семенным способом.

Для этого нужно подготовить субстрат из лиственного перегноя, торфа и песка (4:4:1). Посеять поверх субстрата семена, не укрывая их. После этого контейнер прикрывают стеклом, для образования тепличных условий.

Чтобы семечки проросли, кроме высокой влажности им нужны рассеянное освещение и температура близкая к 17°С. Также не забывайте каждый день проветривать посев и опрыскивать его водой.

В зависимости от того какого возраста семена, на промежутке от 7 до 30 дней вы получите всходы.

Размножение кислицы дочерними луковицами

Легче всего размножить кислицу, отделив от главного корня, дочерние образования. Далее материал просто рассаживают, размещая в одном горшке по несколько корешков или луковиц, и немного присыпают почвой. После этого контейнер размещают в слабо освещаемом, прохладном месте, иногда поливая грунт.

Когда проклюнутся ростки, горшок переносят на свет. А через 30-40 дней у вас уже будет молодой свежий куст.

Кислица размножение делением корневища

Деление корня тоже довольно простой способ. По окончании периода покоя, когда растение выгонит молодой лист, корневище нужно вытащить из почвы, очистить и обработать легким раствором марганца. После этого его делят на части, припудривают надрезы древесным углем и высаживают в отдельные контейнеры.

Емкости с посаженным ставят под рассеянным освещением и поливают по мере высыхания почвы. А с 15 дня после посадки начинают удобрять два раза на 30 дней.

Кислица размножение листом

Также можно размножить цветок листом. Чтобы это сделать выбирайте растение не меньше 10 см высотой и минимум с тремя листьями.

Листок просто отрезается и помещается в воду. Со временем появятся корни, когда они станут больше, просто черенок посадите в почву. Поливайте молодой цветочек, и скоро он начнет выгонять новые листики.

Болезни и вредители

В целом кислица не боится болезней и вредителей, но если неправильно за ней ухаживать, то возможен и такой исход:

• Чаще всего на растение нападают паутинный клещ, тля и щитовка. Против клеща борются актелликом, тлю уничтожают раствором мыла или водой с мандариновыми корками, от щитовки избавляются актарой.
• При излишке влаги, кислица может заболеть серой гнилью или фузариозом. От обеих хворей избавляются с помощью фундазола.
• Если ваша кислица не открывает листья, то, скорее всего, проблема в уходе. Чаще всего такое происходит из-за пересыхания почвы или при слишком сухом воздухе.
• Вянуть кислица чаще всего начинает при избытке влаги, а также при истощении грунта. Если увядание происходит на зиму и после этого она сбрасывает листья, то это подготовка к периоду покоя.
• Бывает, что у кислицы сохнут листья. Обычно это связано с тем, что ее размещают на солнце и листва получает ожоги. Также подобное случается из-за сухого воздуха и слишком высокой температуры.
• Помимо этого листья могут сохнуть потому, что купленное растение еще не привыкло к новым условиям, нужно просто подождать пока оно акклиматизируется.

Влияние кислотных осадков на размножение птиц

(PDF) ВЛИЯНИЕ ПОДКИСЛЕНИЯ НА ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ РЫБ

Ikuta et al. 45

Ричардсон. Gen. Comp. Эндокринол. 76:

310-321.

Икута, К., Т. Шикама, С. Ода и Н. Окумото.

1992. Кислотостойкость глазированных эмбрионов и

личинок лососевых рыб. Бык. Natl. Res.

Инст. Аквакультура. 21: 39-45.[На японском

с аннотацией на английском]

Икута, К. и С. Китамура. 1995. Влияние воздействия низкого pH

взрослых лососевых на метогенез ga-

и развитие эмбрионов.

Загрязнение воды, воздуха и почвы. 85:

327-332.

Икута, К., С. Китамура, Т. Яда, Т. Нисимура, Ф.

Ито, М. Ямагути и М. Ивата. 1996.

Подкисление внутренних водоемов и рыбы.

Биологические науки. 48 (2): 82-89. [На

на японском языке]

Икута, К., С. Китамура, Т. Яда, Т. Адзума, Ф. Ито,

М. Мураяма, М. Ямагути, Т.

Нисимура, Т. Канеко, А. Ишимацу и

М. Ивата. 1997. Разработка и применение

систем оценки воздействия подкисления на экосистемы внутренних вод

в Восточной Азии. Отчет о проделанной работе

Grobal Environmental Research —

Acid Rain. IV: 62-66. [На японском языке с

аннотации на английском]

Икута, К., М. Амано и С. Китамура. 1999. Ef-

Воздействие кислотных дождей на внутренние водные ресурсы

экосистема — воздействие на рыбу.

Канкёкагакукаиси. 12 (2): 259-264. [На

на японском языке]

Ивата, М., Ю. Шимояма, Н. Сакаи, К. Судзуки,

Х. Ида, К. Муто и У. Акуцу. 1990.

Влияние сернокислотного стресса на осмо-

регулирующую способность японского гольца

(Sulvelinus leucomaenis). Бык. Natl. Res.

Инст. Аквакультура.18: 31-37. [На японском

с аннотацией на английском]

Японское агентство по окружающей среде. 1997. Progress

Отчет о 3-м мониторинге кислотных дождей,

, стр. 203-252. В: Japan Environmental

Agency (ed.), Location of Global

Environment-Acid Rain (Chuohoki Pub-

lations, Tokyo, [на японском языке]

Kakizawa, S., T. Kaneko and T. Hirano. 1996.

Повышение концентрации соматолактина в плазме —

при ацидозе радужной форели

(Oncorhynchus mykiss).J. Exp. Биол. 199:

1043-1051.

Какидзава, С., А. Ишимацу, Т. Такеда, Т. Канеко

и Т. Хирано. 1997. Возможное участие —

соматолактина в регулировании

бикарбоната плазмы для компенсации

ацидоза радужной форели. J. Exp. Биол.

200: 2675-2683.

Канеко, Т. 1997. Ионная регуляция и хлоридная клетка

у рыб: адаптация к различной ионной среде

, а также функции и разнообразие хлоридных клеток.Кагаку — Сейбуцу.

35 (5): 376-382. [На японском языке]

Китамура С. и К. Икута. 2000. Кислотный дождь se-

полностью подавляет нерест химэ

лосося (нерка, не имеющая выхода к морю,

Oncorhynchus nerka). Акват. Toxicol.

51: 107-113.

Левестед, Х. и И.П. Мунис. 1976. Гибель рыбы при

низком pH в норвежской реке. Природа. 259:

391-392.

Паркер, Д. Б. и Б.А. Маккеун. 1987. Эффекты низкого pH на яйце и алевине-сур-

.

Выживание кокани и нерки,

Oncorhynchus nerka.Комп. Biochem.

Physiol. 87С (2): 259-268.

Сатаке, К., А. Ояги и Ю. Ивао. 1995. Естественное

закисление озер и рек в Японии:

экосистема озера Усорико (pH

3,4–3,8). Загрязнение воды, воздуха и почвы.

85: 511-516.

Schofield, C.L. 1976. Кислотные осадки: воздействие

на рыбу. Амбио. 5 (5-6): 228-230.

Яда Т. и Ф. Ито. 1997. Различия в толерантности к кислой среде между двумя видами тилапии

, Oreochromis niloticus

и O.mossambicus. Бык. Natl. Inst.

Рыба. Sci. 9: 11-18.

Яда Т. и Ф. Ито. 1998. Половые различия в кислотоустойчивости

medaka Oryzias latipes.

Рыба. Sci. 64 (5): 694-699.

Яда Т., Т. Азума, С. Китамура и К. Икута.

2000. Дозозависимый эффект воздействия

кислой воды на уровни натрия в плазме

радужной форели. Бык. Natl. Res. Inst.

Аквакультура. 29: 217-224. [На японском языке

с аннотацией на английском языке]

Активность дельта-6-десатуразы в кишечнике определяет диапазон хозяев для полового размножения токсоплазмы

Abstract

Многие эукариотические микробы имеют сложные жизненные циклы, которые включают как половую, так и бесполую фазы со строгой видовой специфичностью. В то время как бесполый цикл протистанского паразита Toxoplasma gondii может иметь место у любого теплокровного млекопитающего, половой цикл ограничен кишечником кошек. Молекулярные детерминанты, которые определяют кошек как окончательных хозяев для T . gondii неизвестны. Здесь мы определили механизм видовой специфичности для T . gondii полового развития и преодоления видового барьера, чтобы позволить половому циклу протекать у мышей. Мы определили, что Т . gondii половое развитие происходит, когда в культивируемые эпителиальные клетки кишечника кошек добавляется линолевая кислота. Кошки — единственные млекопитающие, у которых отсутствует активность дельта-6-десатуразы в кишечнике, которая необходима для метаболизма линолевой кислоты, что приводит к системному избытку линолевой кислоты. Мы обнаружили, что ингибирование мышиной дельта-6-десатуразы и добавление к их рациону линолевой кислоты позволило получить T . gondii половое развитие мышей. Этот механизм видовой специфичности был впервые определен для полового цикла паразита.В этой работе показано, как диета и метаболизм хозяина влияют на коэволюцию микробов. Ключ к открытию видовых границ для других эукариотических микробов может также зависеть от липидного состава их окружающей среды, поскольку мы видим все больше доказательств важности липидного метаболизма хозяина во время паразитических жизненных циклов. Беременным женщинам не рекомендуется работать с наполнителем для кошачьего туалета, поскольку у матери есть инфекция, вызванная T . gondii может передаваться плоду с потенциально летальным исходом.Знание молекулярных компонентов, которые создают благоприятную среду для T . gondii половое размножение позволит разработать терапевтические средства, предотвращающие выделение T . gondii паразитов. Наконец, учитывая текущую зависимость от домашних животных для изучения T . gondii половое развитие, эту работу позволит T . gondii field для использования альтернативных моделей в будущих исследованиях.

Образец цитирования: Martorelli Di Genova B, Wilson SK, Dubey JP, Knoll LJ (2019) Активность дельта-6-десатуразы кишечника определяет диапазон хозяев для полового размножения Toxoplasma .ПЛоС Биол 17 (8): e3000364. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364

Академический редактор: Борис Стрипен, Университет Джорджии, США

Поступила: 19 июня 2019 г .; Принята к печати: 17 июля 2019 г .; Опубликовано: 20 августа 2019 г.

Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, модифицировать, дополнять или иным образом использовать в любых законных целях.Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения (NIH), Награда Национальной исследовательской службы T32 AI007414 (SKW), R01AI144016-01, 5R21AI1123289-02 и 5R03AI104697-02 (LJK) и стипендия Morgridge Metabolism Interdisciplinary. из Исследовательского института Моргриджа (BMDG).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Сокращения: АО2, аминоксидаза, медьсодержащий белок 2; BRP1, брадизоит роптрийный белок-1; DBA, Dolichos biflorus агглютинин; GRA11B, плотные гранулы белка 11В; МОИ, множественность заражения; КПЦР, количественная ПЦР; RNAseq, Секвенирование РНК; SAG1, поверхностный антиген 1; TUB1A, тубулин 1А; ЗО-1, зона окклюденс-1

Введение

Апикомплексный паразит Toxoplasma gondii вызывает хроническую инфекцию почти у одной трети населения и известен тем, что вызывает врожденные инфекции, приводящие к слепоте, умственной отсталости и гидроцефалии развивающегося плода. Т . gondii имеет сложный жизненный цикл, включающий как половую, так и бесполую фазы. Модель T . gondii бесполый цикл может возникнуть у любого теплокровного животного при употреблении зараженной пищи или воды, а также T . gondii распространяется по всему хозяину, превращаясь в инцистированную форму в мышцах и тканях мозга. В отличие от T . Половой цикл gondii ограничен эпителием кишечника кошек, кульминацией которого является выделение экологически устойчивых ооцист [1].Молекулярная основа этой видовой специфичности неизвестна.

При заражении кошек проглоченные брадизоиты выделяются пепсином и кислотой в желудке. Затем брадизоиты проникают в эпителий кишечника кошек и дифференцируются на пять морфологически различных типов шизонтов [2]. В течение 2 дней в кишечнике кошек паразиты проходят все пять стадий развития шизонтов, а затем превращаются в мерозоитов. Мерозоиты претерпевают ограниченную пролиферацию от двух до четырех удвоений, прежде чем они дифференцируются в макрогаметы и микрогаметы. Макро- и микрогаметы сливаются с образованием диплоидных ооцист, которые развивают толстые непроницаемые стенки и выделяются с фекалиями. Кошки обычно выделяют 2–20 миллионов ооцист в день с калом и обычно выделяют ооцисты через 5–10 дней после заражения [3,4]. В условиях окружающего воздуха и температуры ооцисты подвергаются процессу спороношения, созревая и становясь заразными. И митоз, и мейоз происходят во время споруляции с образованием восьми гаплоидных спорозоитов, заключенных в стенку ооцисты. Т . Ооцисты gondii стабильны в течение 18 месяцев в неблагоприятных условиях окружающей среды и устойчивы ко многим химическим дезинфицирующим средствам [5].

Результаты и обсуждение

Линолевая кислота имеет решающее значение для полового развития в культивируемых клетках кошек

Для определения молекулярных механизмов, определяющих видовую специфичность T . gondii , мы создали органоиды кишечника кошек (рис. 1а), а затем высеяли эти эпителиальные клетки на покровные стекла. Эти монослои проявляют свойства кишечного эпителия, включая поляризацию и образование плотных стыков (рис. 1b).Для имитации естественного заражения: T . gondii собирали из мозга мышей через 28-40 дней после первичного заражения, и паразиты были выпущены из кист головного мозга с помощью пепсина и кислотного переваривания. После нейтрализации карбонатом натрия паразитов высевали на монослои кишечника кошек, инкубировали в течение 5 дней и окрашивали на маркеры пресексуальной стадии паразита, называемые мерозоитом [6,7]. Хотя мы наблюдали случайное окрашивание плотного гранулярного белка 11B (GRA11B) и брадизоитного белка-1 (BRP1), подавляющее большинство культур было отрицательным по этим мерозоитным маркерам (рис. 1c), что свидетельствует о том, что необходимое питательное вещество ограничивало в этих условиях культивирования. .Поскольку недавние исследования показали, что модель T . gondii бесполые стадии убирают жирные кислоты, особенно олеиновую кислоту, из организма хозяина [8], и что половое развитие многих грибов зависит от линолевой кислоты [9], мы предположили, что добавление этих жирных кислот может облегчить T . gondii половое развитие. Мы добавили 200 мкМ олеиновой или линолевой кислоты в монослойную культуральную среду кишечника кошки за 24 часа до инфицирования T . gondii .После 5 дней заражения мы обнаружили, что добавление линолевой кислоты, но не олеиновой кислоты, вызывает примерно 35% T . gondii , чтобы экспрессировать оба маркера мерозоитной стадии (рис. 1d – 1g и 2a, данные S1). Точно так же мРНК GRA11B была значительно больше в клетках кишечника кошек, дополненных линолевой кислотой, по сравнению с любым другим состоянием (рис. 2b, данные S2). Как видно из кишечника кошек in vivo, GRA11B изменяет локализацию из плотных гранулярных органелл паразита на ранних стадиях развития на паразитофорную вакуоль и мембрану паразитофорной вакуоли на более поздних стадиях развития [6].Мы видим сходную локализацию GRA11B в зависимости от размера вакуолей, вероятно, представляющих раннюю, среднюю и позднюю стадии (Рис. 1e – 1g). Сходным образом BRP1 имеет локализацию, подобную той, что ранее наблюдалась в органеллах rhoptry на апикальном конце мерозоитов [7] (Fig 1e-1g).

Рис. 1. Линолевая кислота способствует развитию половой жизни.

(a) Органоиды кишечника кошек были получены из срезов тонкого кишечника и выращены в матриксе базальной мембраны. Пример растущего органоида, полоска размером 100 мкм.(b) Органоиды кишечника диссоциировали с использованием трипсина, и отдельные клетки высевали на покровные стекла для роста в виде монослоев. Клетки в монослое экспрессировали белок плотных контактов ZO-1 (зеленый), столбик размером 20 мкм. Монослои кишечника кошек инкубировали либо (c) без добавления жирных кислот, (d) 200 мкМ олеиновой кислоты, либо (e, f, g) 200 мкМ линолевой кислоты в течение 24 часов, а затем инфицировали брадизоитами ME49 в течение 5 дней. Паразиты, подвергающиеся пресексуальному развитию, обычно наблюдались только при добавлении линолевой кислоты, что было отмечено окрашиванием GRA11B (красный) или BRP1 (зеленый).Паразиты на (д) ранних, (е) средних или (ж) поздних стадиях полового развития были отмечены по дифференциальной локализации GRA11B. Все панели имеют размер 20 мкм ² с белой полосой размером 5 мкм в правом нижнем углу. BRP1, брадизоит роптрийный белок-1; ДИК — дифференциально-интерференционный контраст; GRA11B, плотные гранулы белка 11B; ZO-1, окклюдированная зона 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.g001

Рис. 2. Количественное определение мерозоитов в культуре тканей кошек.

(a) Органоиды кишечника кошек были диссоциированы трипсином и затем выращены в виде монослоев на предметных стеклах. Срезы были разделены на три разные группы: без добавок FA, с добавлением 200 мкМ OA или с добавлением 200 мкМ LA. Монослои инфицировали Т . gondii брадизоитов ME49, выделенных из мозга мышей с хронической инфекцией при MOI 1:10. Через пять дней после инфицирования окрашивание на GRA11B и BRP1 вместе с DAPI позволило определить процент вакуолей, положительных по GRA11B и BRP1, от общего числа вакуолей.Общее количество паразитофорных вакуолей подсчитывали с помощью положительного окрашивания DAPI и подтверждали морфологией с помощью DIC. Было подсчитано три биологических повтора, и в среднем 35% всех вакуолей были положительными как для GRA11B, так и для BRP1 в монослоях, дополненных LA. * p -значение = 0,0126 с N = 3 по двустороннему непарному тесту t . Деформацию как для BRP1, так и для GRA11B использовали для обеспечения подсчета стадий мерозоитов. RNAseq и иммунофлуоресцентная визуализация эпителия кишечника кошек показывают, что GRA11B экспрессируется исключительно в мерозоитах [6].BRP1 — это белок rhoptry, который первоначально был обнаружен в брадизоитах; однако он выражен и в мерозоитах [7]. (b) Монослои кишечника кошек выращивали, как описано в (а), за исключением того, что монослои гасили TRIzol через 5 дней после заражения, экстрагировали РНК и синтезировали кДНК с использованием праймера олиго (dT) для амплификации мРНК. Экспрессию SAG1 и GRA11B количественно оценивали с помощью кПЦР и рассчитывали кратное изменение по сравнению с неинфицированными клетками. TUB1A использовался для нормализации экспрессии генов в образцах. Экспрессия GRA11B была значительно выше в монослоях, дополненных LA, с двумя биологическими повторами. * p -значение = 0,0155 с N = 2 по двустороннему непарному тесту t . BRP1, брадизоит роптрийный белок-1; ДИК — дифференциально-интерференционный контраст; FA, жирная кислота; GRA11B, плотные гранулы белка 11B; LA, линолевая кислота; MOI — множественность инфекции; ОА, олеиновая кислота; qPCR, количественная ПЦР; RNAseq — секвенирование РНК; ТУБ1А, тубулин 1А; SAG1, поверхностный антиген 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.g002

Известно, что в кишечнике кошек мерозоиты дифференцируются на микро- и макрогаметы, которые сливаются в диплоидные ооцисты. После 7 дней заражения мы наблюдали круглые структуры с реактивностью к макрогамете протеинаминоксидазы, медьсодержащему протеину 2 (AO2) [10] в монослоях кишечника кошек, культивированных с 200 мкМ линолевой кислоты, но не в культурах без добавок или олеиновой кислоты. (Рис. 3a – 3c).ПЦР этих 7-дневных культур, дополненных линолевой кислотой, усилила сообщение для AO2, а также предсказанного моторного белка динеина жгутика микрогаметы TGME49_306338 с 44% идентичностью гомологу из подвижной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii (рис. 3d). Параллельно, мы оценили наличие внутриклеточного биогенеза стенки ооцисты в этих клетках кошек с добавкой линолевой кислоты с помощью антитела 3G4 [11], которое распознает T . gondii стенка ооцисты.Было примерно девять стенок ооцист на см. ² культивируемых кошачьих клеток с добавлением 200 мкМ линолевой кислоты, но ни одного в культурах без добавок или олеиновой кислоты (рис. 3e – 3h, данные S3). Добавление 20 мкМ линолевой кислоты не увеличивало продукцию стенки ооцисты, указывая на то, что концентрация линолевой кислоты была критической для правильного развития.

Рис. 3. Идентификация гамет и внутриклеточных ооцист в культуре ткани кошки.

Органоиды кишечника кошек были диссоциированы трипсином и затем выращены в виде монослоев на предметных стеклах. Монослои выращивали до слияния, а затем инкубировали либо без добавления жирных кислот (a и e), 200 мкМ олеиновой кислоты (b и f), либо 200 мкМ линолевой кислоты (c и g) в течение 24 часов и инфицировали очищенными брадизоитами ME49. из мозга хронически инфицированных мышей. Через 7 дней монослои инкубировали с мышиным анти-AO2 (a – c) или мышиным моноклональным IgM 3G4 (e – g). Чувствительный к амилориду AO2 — это фермент, экспрессирующийся исключительно в макрогаметах и ​​ранних ооцистах, и он, возможно, играет роль в биогенезе стенки ооцисты [10].Экспрессия АО2 была обнаружена только с помощью иммунофлуоресценции в монослоях, дополненных линолевой кислотой (c). 3G4 — мышиное моноклональное антитело, полученное иммунизацией мышей очищенными стенками ооцист [11]; таким образом, он является маркером биогенеза стенки ооцисты. Только монослои, дополненные линолевой кислотой (g), имели положительные вакуоли 3G4. Все панели имеют размер 20 мкм ² с белой полосой размером 5 мкм в правом нижнем углу. (d) Маркеры экспрессии макрогаметы и микрогаметы также оценивали с помощью ПЦР.Монослои кишечника кошек выращивали в 24-луночных планшетах до слияния, а затем инфицировали Т . gondii брадизоитов в двух экземплярах с использованием тех же условий, что и выше. Через семь дней после заражения РНК экстрагировали с помощью TRIzol, и кДНК синтезировали с использованием праймера олиго (dT) только для амплификации мРНК. АО2 снова использовали в качестве маркера для макрогамет, и ожидаемый продукт ПЦР составляет 218 п.н. Для оценки наличия микрогаметы мы выбрали ген TgME49_306338, который сверхэкспрессируется на стадии гамет, соответствует 7-му дню после инфицирования у кошек [12] и имеет 44% идентичности с белком, экспрессируемым в жгутиках подвижных зеленых водорослей C. . reinhardtii . Ожидаемый продукт ПЦР для TgME49_306338 составляет 160 п.н. TUB1A использовали в качестве входного контроля, и в результате был получен продукт длиной 172 пар оснований. «Нет RT» соответствует реакции синтеза кДНК без добавления RT в качестве контроля загрязнения геномной ДНК. Эквивалентные количества кДНК на образец использовали в качестве матрицы для каждой реакции ПЦР, и продукты разделяли на акриламидном геле. Полосы правильного размера, показывающие экспрессию AO2 и TgME49_306338, наблюдались только в монослоях, дополненных линолевой кислотой.(h) Количество положительных стенок ооцисты, окрашенных 3G4, определяли количественно. Монослои кишечника кошек инфицировали Т . gondii брадизоитов и через 7 дней фиксировали 3,7% формальдегидом в PBS и инкубировали с 3G4, как показано на (e, f и g). Количество положительных стенок ооцист подсчитывали на каждом слайде и делили на площадь слайда в см ² . Число положительных стенок ооцист в монослоях с добавлением линолевой кислоты было значительно выше, чем в тех, которые были дополнены олеиновой кислотой в трех биологических повторностях.* p -значение = 0,0272 с N = 3 по двустороннему непарному тесту t . АО2, аминоксидаза, медьсодержащий белок 2; ДИК — дифференциально-интерференционный контраст; IgM, иммуноглобулин M; RT — обратная транскриптаза; ТУБ1А, тубулин 1А.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.g003

Ингибирование дельта-6-десатуразы вызывает половое развитие в клеточной культуре клеток мыши

Зависимость Т . gondii половое развитие при высоком уровне линолевой кислоты было интригующим, потому что кошки — единственные млекопитающие, у которых отсутствует активность дельта-6-десатуразы в тонком кишечнике [13,14].Дельта-6-десатураза является первой и лимитирующей стадией превращения линолевой кислоты в арахидоновую кислоту. Линолевая кислота является доминирующей жирной кислотой в сыворотке кошек, составляя 25–46% от общего количества жирных кислот [15–18], тогда как сыворотка грызунов содержит только 3–10% линолевой кислоты [19–22]. Мы предположили, что отсутствие активности дельта-6-десатуразы в тонком кишечнике кошек позволяет накапливать линолевую кислоту из рациона, которая затем действует как положительный сигнал для T . gondii половое развитие.Чтобы проверить эту гипотезу, мы инфицировали монослои кишечника мышей Т . gondii и дополнили их линолевой кислотой и химическим веществом SC-26196, специфическим ингибитором фермента дельта-6-десатуразы, для установления высоких стабильных уровней линолевой кислоты [23]. Через пять дней после заражения культуры мышей Т . gondii мы оценили маркеры мерозоитов BRP1 [7] и GRA11B [6]. Мы обнаружили экспрессию GRA11B и BRP1 в клетках кишечника мышей только при добавлении линолевой кислоты и SC-26196 (рис. 4).Эти данные предполагают, что фермент дельта-6-десатураза должен быть ингибирован для того, чтобы достаточно высокие уровни экзогенной линолевой кислоты увеличились и индуцировали Т . gondii половое развитие в клетках кишечника не кошачьих. Подобно клеткам кошек, монослои кишечника мышей, дополненные как линолевой кислотой, так и SC-26196, содержали приблизительно 26% T . gondii вакуолей, экспрессирующих как BRP1, так и GRA11B (фиг. S1, данные S4).

Рис. 4. Ингибирование дельта-6-десатуразы способствует половому развитию в культуре мышей.

Монослои кишечника мышей инкубировали либо (а) без добавления жирных кислот, (b) 200 мкМ линолевой кислоты, либо (в, d, e) 200 мкМ линолевой кислоты плюс ингибитор дельта-6-десатуразы («D6D inh. ”) SC-26196 в течение 24 часов, а затем инфицировали брадизоитами ME49 в течение 5 дней. Только в культурах, дополненных линолевой кислотой и SC-26196, паразиты, подвергающиеся пресексуальному развитию, были обнаружены путем окрашивания GRA11B (красный) или BRP1 (зеленый). Паразиты на (в) ранней, (г) средней или (д) поздней стадиях развития были отмечены дифференциальной локализацией GRA11B.Все панели имеют размер 20 мкм ² с белой полосой размером 5 мкм в правом нижнем углу. BRP1, брадизоит роптрийный белок-1; ДИК — дифференциально-интерференционный контраст; GRA11B, плотные гранулы белка 11B.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364. g004

Ингибирование дельта-6-десатуразы вызывает половое развитие у живых мышей

Ооцисты, выделяемые с фекалиями кошек, должны пройти процесс споруляции, чтобы стать заразными для следующего хозяина. Мы попытались спорулировать круглые структуры, содержащие антиген стенки ооцисты, которые были получены либо от кошачьих, либо от ингибированных культивированных клеток кишечника мыши при комнатной температуре с аэрозолизацией в течение 7–14 дней.К сожалению, из монослоев было получено мало структур, они, по-видимому, не спорулировали и не были заразными для мышей. Мы предположили, что T . gondii Развитие ооцисты и инфекционность потребуют физиологических условий у всего животного, которые не могут быть воспроизведены в культуре ткани. Чтобы проверить эту гипотезу, мы подавили активность дельта-6-десатуразы в кишечнике живых мышей. Ингибитор дельта-6-десатуразы SC-26196 эффективен в качестве противовоспалительного агента в экспериментах на животных [24]. Поскольку ранее было замечено, что спорозоиты перешли в быстро воспроизводящуюся бесполую стадию, называемую тахизоитом, в течение 8 часов после пероральной инокуляции крысам [25] мы кормили мышей диетой, богатой линолевой кислотой, и предварительно обрабатывали их дельта-6-десатуразой. ингибитор SC-26196 (или контроль без ингибитора) за 12 часов до перорального инфицирования T . gondii , а затем каждые 12 часов. У мышей, получавших как диету, богатую линолевой кислотой, так и ингибитор SC-26196, через 7 дней после заражения количественная ПЦР (qPCR) кДНК подвздошной кишки показала высокую экспрессию T . gondii мерозоитный маркер GRA11B и низкая экспрессия бесполого тахизоитного поверхностного антигена 1 (SAG1) [26] (рис. 5a, данные S5). Срезы подвздошной кишки на 7-й день после инфицирования заливали парафином и окрашивали гематоксилином и эозином или ретикулином. Пресексуальная и ранняя стадии ооцист присутствовали только в ткани мышей, получавших линолевую кислоту и ингибитор дельта-6-десатуразы (рис. 5b и 5c).

Рис. 5. Мыши выделяют ооцисты после ингибирования D6D.

Мышам вводили через желудочный зонд LA и ингибитор D6D («Inh.”) SC-26196 за 12 часов до заражения брадизоитами ME49, а затем каждые 12 часов в течение 7 дней заражения. (а) КПЦР кДНК из подвздошной кишки для тахизоитного маркера SAG1 (черный) и GRA11B (красный) показывает, что GRA11B значительно повышается только в присутствии SC-26196 ( p -значение = 0,0057 с N = 2 двусторонним непарным тестом t ). (b) Срезы подвздошной кишки на 7 день после инфицирования заливали парафином и окрашивали гематоксилином и эозином для визуализации пресексуальных стадий.(c) Ранние внутриклеточные ооцисты наблюдались в подвздошной кишке D6D-ингибированных мышей, пропитанных серебром (ретикулиновое окрашивание) и сфотографированных с использованием дифференциальной контрастной визуализации, чтобы выделить стенку ооцисты в темно-коричневый цвет [27]; Черная полоса размером 10 мкм в правом нижнем углу. (d) Свежие ооцисты фиксировали в 3,7% формальдегиде в суспензии, инкубировали с мышиным моноклональным антителом 3G4 в течение ночи, а затем инкубировали с козьим антимышиным вторичным антителом Alexa Fluor 488. Панели имеют размер 20 мкм ² с полосой белого размера 5 мкм в правом нижнем углу.D6D, дельта-6-десатураза; ДИК — дифференциально-интерференционный контраст; FA, жирная кислота; GRA11B, плотные гранулы белка 11B; LA, линолевая кислота; qPCR, количественная ПЦР; SAG1, поверхностный антиген 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.g005

Уже на 6-й день после инфицирования в кале мышей присутствовали ооцистоподобные структуры, показывающие позитивное окрашивание на антитела 3G4 (рис. 5d), и их количество увеличивалось в число до 7 дня, когда мышей умерщвляли. qPCR на геномной ДНК из образцов фекалий мышей показала, что T .Геномная ДНК gondii обнаруживалась только у мышей, обработанных SC-26196 (фиг. 6a, данные S6), что указывает на то, что дельта-6-десатураза должна быть инактивирована у мышей для T . gondii половых стадий развития в кишечнике мыши. Мыши продуцировали 1 000–10 000 ооцист на грамм сухих фекалий. Для увеличения количества и продолжительности выделения ооцист мышам давали ингибитор SC-26196 каждые 12 часов только до 5 дня после инфицирования. Ооцисты контролировали в фекалиях, пик выделения приходился на 8-9 дни с содержанием от 100 000 до 150 000 ооцист / грамм сухих фекалий (рис. 6b, данные S7), что находится в пределах диапазона, наблюдаемого для кошек (2 000–1 500 000 ооцист / грамм). фекалий [3,4]).

Рис. 6. Ооцисты мышей заразны.

(a) КПЦР на геномной ДНК из образцов фекалий мыши показывает, что T . Геномная ДНК gondii обнаруживается только у мышей, получавших SC-26196 ( p -значение = 0,0002 с N = 3 по двустороннему непарному тесту t ). (b) Подсчет количества ооцист на грамм фекалий с течением времени. *** p -значение = 0,0003 день 5 по сравнению с 8 и ** p -значение = 0,0017 день 9 по сравнению с 14. (c) Через 7 дней в условиях споруляции спороцисты были видны с помощью DIC, и синяя автофлуоресценция стенки ооцисты были усилены.Все панели имеют размер 20 мкм ² с белой полосой размером 5 мкм в правом нижнем углу. (d) Для воздействия на стенку спороцисты антитела 4B6 [11] спорулированные ооцисты сушили на предметных стеклах, фиксировали и пропитывали холодным ацетоном в течение 30 минут, инкубировали с мышиным моноклональным антителом 4B6 в течение ночи, а затем инкубировали с козьими анти- Вторичное антитело мыши Alexa Fluor 488. (e) Через 28 дней ИП с ооцистами Т . gondii цисты были выделены из мозга мышей и обнаружены с помощью DBA [28] (красный).Все панели имеют размер 20 мкм ² с белой полосой размером 5 мкм в правом нижнем углу. D6D Inh., Ингибитор дельта-6-десатуразы; DBA, Dolichos biflorus агглютинин; ДИК — дифференциально-интерференционный контраст; FA, жирная кислота; LA, линолевая кислота; ИП — постинфекция; КПЦР, количественная ПЦР.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.g006

Ооцисты, полученные от мышей, спорулируют и являются инфекционными

Т . gondii ооцисты чувствительны к высыханию, что делает их неспособными к споруляции [29].Поэтому фекалии мышей или содержимое кишечника немедленно помещали в физиологический раствор и спорулировали при комнатной температуре с аэрозолизацией. Ооцисты кошачьего происхождения обычно стабильны после 30-минутной инкубации в неразбавленном отбеливателе (5% гипохлорита натрия) и длительной инкубации в 2% серной кислоте [5]. Поскольку ооцисты, полученные от мышей, не были столь устойчивы к отбеливателю и 2% -ной серной кислоте, как ооцисты кошачьих, они спорулировали в физиологическом растворе с антибиотиками. Через 7 дней споруляция была очевидна примерно в 50% ооцист по визуализации спорозоитов, темно-синей аутофлуоресцентной стенки [30] (рис. 6c) и реактивности с антителом 4B6, которое распознает две отдельные спороцисты в ооцистах [11] (Рис 6d). Спорулированные ооцисты были инфекционными для мышей, что видно по конверсии сыворотки (S2 фиг.) И цистам в головном мозге через 28 дней (фиг. 6e, S3 фиг.). Подобно ооцистам, полученным от кошек, эти спорулированные ооцисты мыши были стабильными и заразными в течение не менее 3 месяцев при хранении при 4 ° C.

Заключительные замечания

В совокупности эти результаты определяют механизм видовой специфичности для T . gondii полового развития и показывают, что видовой барьер может быть преодолен для T . gondii половое развитие путем ингибирования активности дельта-6-десатуразы в кишечнике не кошачьего хозяина. Отсутствие активности дельта-6-десатуразы и накопление линолевой кислоты, вероятно, увеличивает T . gondii половое развитие несколькими путями. Во-первых, предыдущие исследования предполагают, что линолевая кислота цитотоксична для стадии бесполого тахизоита [31]; таким образом, развитие тахизоитов будет остановлено в среде, богатой линолевой кислотой. Во-вторых, ингибирование дельта-6-десатуразы, вероятно, снижает уровень арахидоновой кислоты, что может изменить выработку иммунных липидных медиаторов, известных как эйкозаноиды.Наконец, резкое различие между олеиновой кислотой с одной двойной связью и линолевой кислотой с двумя показателями того, что линолевая кислота, вероятно, используется как сигнальная молекула, а не для удовлетворения основных потребностей в питании. Определение кворума для полового размножения у грибов зависит от оксигенации линолевой кислоты, но не олеиновой кислоты [9]. Множественный хост и Т . gondii циклооксигеназы и липоксигеназы могут оксигенировать линолевую кислоту до сигнальной молекулы оксилипина для T . gondii продолжение полового развития. Другие простейшие паразиты также полагаются на липиды, полученные от хозяина, которые могут использоваться в качестве сигнальных молекул, а также в качестве источников липидов для роста паразитов в течение их жизненных циклов [32,33].

Материалы и методы

Заявление об этике

Мышей лечили в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Школы медицины и общественного здравоохранения Университета Висконсина (протокол № M005217).Кошек лечили в соответствии с инструкциями, установленными IACUC Министерства сельского хозяйства США, район Белтсвилля (протокол № 15–017). Оба учреждения соблюдают правила и рекомендации Национального исследовательского совета.

Органоиды кишечника

Органоиды кишечника кошек были выделены из срезов тощей кишки, полученных из срезов тонкой кишки плода. Органоиды кишечника мышей получали из срезов тощей кишки самцов мышей C57BL / 6J в возрасте 8 недель.Органоиды были получены, как описано ранее [34]. Вкратце, срезы кишечника промывали ледяным PBS, содержащим 0,1 мг / мл стрептомицина и 100 Ед / мл пенициллина, в течение 20 минут. Последовательно добавляли EDTA (Sigma) до конечной концентрации 2 мМ и ткань инкубировали в течение 40 минут при 4 ° C. Затем ткань промывали холодным PBS без EDTA и энергично встряхивали до тех пор, пока в супернатанте не стали видны крипты. Суспензию крипт фильтровали с использованием сетчатого фильтра для клеток 70 мкм, и крипты центрифугировали при 80 g в течение 5 минут.Клетки ресуспендировали в матригеле (BD Biosciences), переносили пипеткой в ​​24-луночный планшет, давали возможность полимеризоваться и затем покрывали органоидной средой. Органоидная среда содержит Advanced DMEM / F12 с 2 мМ глутамакса, 20 мМ HEPES, 1 × B27, 1 × N2, 10% об. / Об. Фетальной бычьей сыворотки, 10 мг / л инсулина, 5,5 мг / л трансферрина, 0,67 мг / л. селенит, пенициллин и стрептомицин (все от Invitrogen), 50 нг / мл человеческого EGF (R&D systems), 10 мМ никотинамид (Sigma), 3 мкМ CHIR99021 и 10 мкМ Y-27632 (оба Selleckchem), и 50% об. / об. среда, полученная из клеточной линии L-WRN (ATCC CRL 3276).Среду меняли через день, и органоиды увеличивали, пропуская клетки через иглу 25 калибра каждую неделю. Все эксперименты проводились с клетками со 2 по 5 пассаж, и клетки регулярно проверялись на загрязнение микоплазмой (MicoAlert Lonza).

Монослои кишечника и добавление жирных кислот

Монослои были получены из органоидов кишечника, как описано ранее [35]. Вкратце, установленные органоиды кишечника кошек или мышей промывали холодным PBS, расщепляли 0.05% m / v трипсина в течение 5 минут при 37 ° C, центрифугировали при 250 g в течение 3 минут и ресуспендировали в свежей предварительно нагретой органоидной среде. Клеточную суспензию добавляли на предметное стекло (Thermo), предварительно покрытое энтактин-коллагеном IV-ламинином (Corning) для кошачьих клеток или 2% м / об. Желатина в PBS (Sigma) для мышиных клеток. Слайды покрывали сушкой на воздухе матрицы базальной мембраны или желатина до сушки на воздухе в течение ночи. Монослои выращивали в течение 10–15 дней до заражения Т . gondii брадизоитов со сменой среды через день, пока клетки не достигнут 90% или более конфлюэнтности.Линолевая кислота или олеиновая кислота, конъюгированные с BSA (Sigma), добавляли к монослоям органоидов до 0,2 мМ за 24 часа до инфицирования.

Приготовление брадизоитов и заражение

мышей C57BL / 6J через желудочный зонд инфицировали 500–1000 ооцист ME49 из кошачьих фекалий. Через 28 дней после заражения мозг удаляли, промывали холодным PBS и гомогенизировали с помощью измельчителя стеклянных тканей. Суспензию центрифугировали при 400 g в течение 10 минут и осадок суспендировали в 20% мас. / Об. Декстране (средний молекулярный вес 150 000, Sigma).Кисты брадизоита осаждали и отделяли от материала головного мозга центрифугированием при 2200 g в течение 10 минут. Осадок промывали PBS, расщепляли 0,1 мг / мл пепсина в HCl в течение 5 минут при 37 ° C, а затем нейтрализовали равным объемом 1% карбоната натрия (Sigma). Брадизоиты центрифугировали при 250 г в течение 10 минут, ресуспендировали в предварительно нагретой органоидной среде и добавляли к монослоям органоидов с множественностью инфицирования 1 брадизоит: 10 кишечных эпителиальных клеток (MOI 1:10).

Ингибирование дельта-6-десатуразы

SC-26196 (Cayman) солюбилизировали в ДМСО и использовали в концентрации 20 мкМ в монослоях органоидов мыши. Для лечения in vivo ингибитор солюбилизировали в 0,5% (м / об.) Метилцеллюлозе, и мышам вводили 50 мг / кг каждые 12 часов через желудочный зонд [24]. Самки мышей C57BL / 6J (возраст 4 недели) с делецией Z-ДНК-связывающего белка [36] были разделены на четыре разные группы: неинфицированный контроль, T . gondii –инфицирован без добавления жирных кислот, T . gondii — заражены добавками линолевой кислоты, и T . gondii –инфицирован линолевой кислотой и ингибитором SC-26196. Каждая мышь, получавшая добавку линолевой кислоты, получала 10 мкл 99% масла линолевой кислоты (MilliporeSigma Cat # 843483), суспендированного в 0,5% метилцеллюлозе, в день через желудочный зонд. Мышей инфицировали 1000 цист головного мозга, очищенных, как описано выше, через желудочный зонд, и умерщвляли через 7 дней после заражения. Размер выборки составлял не менее двух мышей на группу, и эксперимент повторяли пять раз.Альтернативно, каждую мышь инфицировали мозгом одной мыши по крайней мере через 2 месяца после инфицирования по крайней мере 1000 кист. Мышей лечили SC-26196 до 5 дня после инфицирования. Кал собирали на 5–14-й день и ооцисты подсчитывали с помощью микроскопии.

Иммунофлуоресценция

Монослои органоидов кишечника или образцы фекалий мышей фиксировали в 3,7% формальдегиде в PBS в течение 20 минут, пропитывали 0,2% тритоном X-100 (Sigma) в PBS при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем блокировали 3% BSA в PBS при температуре комнатная температура в течение 1 часа.Первичные антитела инкубировали при 4 ° C в течение ночи в 0,2% об. / Об. Triton x-100 и 3% BSA в PBS (1: 100 мышиное анти-GRA11B, 1: 100 кроличье анти-BRP1, 1: 100 мышиное анти-AO2, Моноклональные мышиные анти-ZO-1 в соотношении 1:50 [Santa Cruz] или 1:25 мышиные IgM против стенок ооцисты 3G4). Спорулированные ооцисты из фекалий мышей сушили на предметных стеклах, фиксировали и пропитывали ледяным ацетоном в течение 30 минут и инкубировали с мышиным 4B6 1:20 для визуализации спороцисты. Предметные стекла инкубировали со специфическим вторичным антителом (1: 500 козлиное антитело против кролика Alexa Fluor 488 и 1: 500 козье антитело против мыши Alexa Fluor 594) при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем трижды промывали PBS. Ядра клеток окрашивали 10 мкМ DAPI (Sigma). Слайды помещали в среду для закрепления антифадеров Vectashield (VectorLabs). Образцы получали на Zeiss Axioplan III, оборудованном трехпроходным (DAPI / флуоресцеинизотиоцианат [FITC] / Texas Red) эмиссионным кубом, оптикой дифференциального интерференционного контраста и монохроматической камерой Axiocam, управляемой программным обеспечением Zen (Zeiss) и обработанной с помощью ImageJ ( Пакет Фиджи).

Срезы тканей и гистология

Ileum исправлено в 3.7% формальдегида в PBS в течение ночи, залит в парафин и разделен лабораторией «Инициативы трансляционных исследований в патологии» Университета Висконсин-Мэдисон. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином или ретикулином (серебром).

ПЦР в реальном времени на кДНК подвздошной кишки

Мышей с лечением ингибитором дельта-6-десатуразы и без нее умерщвляли через 7 дней после заражения. У каждой мыши удаляли подвздошную кишку и гомогенизировали в 1 мл TRIzol. (-1 / наклон).Затем метод Pfaffl [37], который учитывает различия в эффективности, был использован для расчета относительной экспрессии генов GRA11B и SAG1 на образец в трех экземплярах. Использовали только лунки с одной температурой кривой плавления, что указывает на единственный продукт. Последовательности праймеров были следующими:

1. TUB1A вперед: 5 ′ –GACGACGCCTTCAACACCTTCTTT– 3 ′
2. Реверс: 5 ′ –AGTTGTTCGCAGCATCCTCTTTCC– 3 ′
3. SAG1 вперед: 5 ′ –TGCCCAGCGGGTACTACAAG– 3 ′
4. Реверс: 5 ′ –TGCCGTGTCGAGACTAGCAG– 3 ′
5. GRA11B вперед: 5 ′ –ATCAAGTCGCACGAGACGCC– 3 ′
6. Реверс: 5 ′ –AGCGAATTGCGTTCCCTGCT– 3 ′

ПЦР в реальном времени для

образцов фекалий мышей с обработкой ингибитором дельта-6-десатуразы и без нее. Геномную ДНК генерировали из 0,1 г фекалий от каждой мыши с использованием набора для ДНК почвы (QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя, за исключением того, что клетки разрушали взбивателем для шариков вместо вихря. Стандартная кривая была построена с использованием серии разведений из 10 ¹ –10 ⁵ паразитов на лунку, амплифицированных с использованием набора праймеров SAG1, описанного выше, на основе образца геномной ДНК с известным количеством паразитов.Значения Ct наносили на график числа паразитов. Число копий гена-мишени в каждом образце можно интерполировать из линейной регрессии стандартной кривой.

ПЦР в реальном времени выполняли для каждого образца в трех экземплярах с использованием Bio-Rad iTaq Universal SYBR Green Supermix в системе Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR. Рассчитанные числа копий каждого образца были нормализованы на основе нг нуклеиновой кислоты, используемой в качестве матрицы ПЦР. Использовали только лунки с одной температурой кривой плавления, что указывает на единственный продукт.

ПЦР монослоев кишечника кошек

Монослои кишечника кошек выращивали в 24-луночных планшетах до слияния, а затем инкубировали либо без добавления жирных кислот, либо с 200 мкМ олеиновой кислотой, либо с 200 мкМ линолевой кислотой в течение 24 часов. Монослои инфицировали брадизоитами ME49, очищенными из мозга хронически инфицированных мышей, в двух экземплярах с неинфицированными монослоями в качестве отрицательного контроля. Через семь дней после заражения РНК экстрагировали с помощью TRIzol, и кДНК синтезировали, как описано выше.TgAO2 использовали в качестве маркера для макрогамет, а TgME49_306338 использовали в качестве маркера для микрогамет. TUB1A использовали в качестве входного контроля с использованием тех же праймеров, что и выше. Реакцию синтеза кДНК без добавления обратной транскриптазы использовали в качестве контроля загрязнения геномной ДНК. Эквивалентные количества кДНК на образец использовали в качестве матрицы для каждой реакции ПЦР, и продукты разделяли на акриламидном геле и отображали. Последовательности праймеров были следующими:

1. TgAO2 вперед: 5 ′ –GTCTTGGTTCGTTGAAGGGGCTG– 3 ′
2. Реверс: 5 ′ –CGTCCTCGATGCCCATGAAATCTG– 3 ′
3. TgME49_306338 вперед: 5 ′ –CCACGTCCTTCGCCGATG– 3 ′
4. Реверс: 5 ′ –CATCAGAGGTCCCAGGTTGTCG– 3 ′

Статистические методы

Все пробы кала с помощью ПЦР в реальном времени анализировали в трех технических повторностях. Разницу между средними числами копий целевого гена анализировали с помощью двусторонних непарных тестов t . ПЦР кишечных образцов в реальном времени запускали в трех повторностях из двух биологических повторностей на группу. Разницу между средней относительной экспрессией каждого целевого гена анализировали с помощью двусторонних непарных тестов t .

Споруляция ооцист и инфекции мышей

Свежие пробы фекалий получали от каждой мыши, гомогенизировали в PBS и затем центрифугировали при 1500 g .Осадок ресуспендировали в PBS плюс пенициллин и стрептомицин, и образцы встряхивали в течение 7–14 дней при комнатной температуре в присутствии кислорода. Ооцисты мышей были стабильны не менее 3 месяцев при 4 ° C. Наивные мыши были инфицированы примерно 250 мышиными ооцистами посредством внутрибрюшинной инъекции. Мышей гуманно умерщвляли на 28 день после заражения, и их мозг удаляли, гомогенизировали и либо инкубировали с биотинилированным DBA 1: 1000, либо очищали с 20% m / v декстраном, как описано выше, перед инкубацией DBA. Затем все цисты инкубировали со стрептавидин-конъюгированным Alexa Fluor-594 1: 1000 и отображали на Zeiss Axioplan III, оборудованном трехпроходным (DAPI / FITC / Texas Red) эмиссионным кубом, оптикой дифференциального интерференционного контраста и монохроматической камерой Axiocam. программой Zen (Zeiss) и обработаны с помощью ImageJ (пакет Fiji).

Вестерн иммуноблот

ME49 обрабатывали на 15% -ном SDS-PAGE протеиновом геле, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и блокировали полоски 5% мас. / Об. Молока с низким содержанием жира в TBS 1.0% об. / Об. Твин-20. Собранную сыворотку разбавляли 1: 250 TBS, 1,0% об. / Об. Tween-20, и использовали 1: 2000 антимышиных HRP в качестве вторичных антител. Сыворотку мышей C57BL / 6, инфицированных кошачьими ооцистами в течение 26 дней, использовали в качестве положительного контроля, а сыворотку от неинфицированных мышей C57BL / 6 использовали в качестве отрицательного контроля. Полосы визуализировали с помощью LI-COR (LI-COR Biosciences) при 700 нм или хемилюминесценции для 5-минутной экспозиции.

Дополнительная информация

S1 Рис. Количественное определение мерозоитов в культуре ткани мышей.

Органоиды кишечника мышей диссоциировали под действием трипсина, и отдельные клетки выращивали на предметных стеклах. Слайды были разделены на три разные группы: без добавления жирных кислот или ингибитора SC-26196, с добавлением 200 мкМ линолевой кислоты или с добавлением 200 мкМ линолевой кислоты и 20 мкМ SC-26196 («D6D + LA»). Монослои инфицировали Т . gondii брадизоиты ME49, выделенные из мозга хронически инфицированных мышей. Через 5 дней после заражения монослои окрашивали на GRA11B, BRP1 и DAPI.Общее количество паразитофорных вакуолей подсчитывали с помощью положительного окрашивания DAPI и подтверждали морфологией с помощью DIC. Определяли процент вакуолей, положительных по GRA11B и BRP1, от общего количества вакуолей. Было подсчитано три биологических повтора, и в среднем 26% всех вакуолей были положительными по GRA11B и BRP1 в монослоях, дополненных линолевой кислотой с добавлением SC-26196. ** p -значение = 0,0039 с N = 3 по двустороннему непарному тесту t .BRP1, брадизоит роптрийный белок-1; ДИК — дифференциально-интерференционный контраст; GRA11B, плотные гранулы белка 11B.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.s001

(TIF)

S2 Рис. Оценка инфекционности ооцист мышей по конверсии сыворотки.

Ооцисты, собранные у мышей, обработанных SC-26196, спорулировали и вводили внутрибрюшинно мышам C57BL / 6. Сыворотку собирали конечным кровотечением через 22 дня (1 и 2), 28 дней (3 и 4) или через 3 месяца (5–10) после инфицирования.Сыворотка неинфицированной мыши использовалась в качестве отрицательного контроля (-). Положительный контроль (+) представлял собой сыворотку от мыши, инфицированной в течение 26 дней ооцистами кошки. Сыворотку инкубировали с нитроцеллюлозой, обработанной лизатом тахизоита ME49. Панель (а) представляет собой хемилюминесценцию, а (б) представляет собой изображение при длине волны 700 нм, показывающее отдельные дорожки и белочную лестницу.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.s002

(TIF)

S3 Рис. Ооцисты мышей заразны.

Через двадцать восемь дней после заражения ооцистами мозг мыши удаляли, гомогенизировали и окрашивали на T . gondii кисты по DBA (красные). Все панели имеют размер 20 мкм ² с белой полосой размером 5 мкм в правом нижнем углу. DBA, D . biflorus агглютинин.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.s003

(TIF)

S1 Данные. Исходные данные для рис. 2а.

Количественное определение двойных положительных вакуолей GRA11B и BRP1 в культуре тканей кошек. Монослои кишечника кошек были разделены на три разные группы: без добавления жирной кислоты, с добавлением 200 мкМ олеиновой кислоты или с добавлением 200 мкМ линолевой кислоты (левый столбец).Монослои инфицировали Т . gondii брадизоитов ME49, выделенных из мозга мышей с хронической инфекцией при MOI 1:10. Через пять дней после инфицирования проводили окрашивание на GRA11B и BRP1 вместе с DAPI. Для каждого случайного поля подсчитывали количество ядер клетки-хозяина вместе с дважды положительными и отрицательными вакуолями GRA11B / BRP1. Для каждой биологической повторности было подсчитано пять различных технических повторностей, и представлено среднее значение. Каждая строка таблицы представляет собой независимый эксперимент, три биологические повторы.BRP1, брадизоит роптрийный белок-1; GRA11B, плотные гранулы белка 11B; MOI, множественность заражения.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.s004

(TIF)

S2 Данные. Исходные данные для рис. 2б.

Необработанные значения Ct TUB1A, SAG1 и GRA11B из кДНК образцов монослоев кишечника кошек с использованием TUB1A в качестве нормализатора экспрессии целевого гена. Лунки с несколькими температурами кривой плавления, указывающими на нецелевые продукты, были исключены («NA»). Образцы с пределом обнаружения ниже 40 циклов помечаются BDL.BRP1, брадизоит роптрийный белок-1; GRA11B, плотные гранулы белка 11B; SAG1, поверхностный антиген 1; ТУБ1А, тубулин 1А.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.s005

(TIF)

S3 Данные. Исходные данные для рис. 3h.

Количественное определение вакуолей, положительных на антитело 3G4 стенки ооцисты в культуре ткани кошки. Монослои кишечника кошек были разделены на три разные группы: без добавления жирной кислоты, с добавлением 200 мкМ олеиновой кислоты или с добавлением 200 мкМ линолевой кислоты (левый столбец).Монослои инфицировали Т . gondii брадизоитов ME49, выделенных из мозга мышей с хронической инфекцией при MOI 1:10. Через семь дней после инфицирования проводили окрашивание на антиген стенки ооцисты антителом 3G4. Для каждой лунки размером 1 см ² подсчитывали общее количество 3G4-положительных вакуолей. Каждый столбец таблицы представляет собой независимый эксперимент, три биологических повтора. MOI, множественность заражения.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.s006

(TIF)

S4 Данные. Исходные данные для S1 Рис.

Количественная оценка двойных положительных вакуолей GRA11B и BRP1 в культуре ткани мышей. Монослои кишечника мышей были разделены на три разные группы: без добавления жирных кислот или ингибитора SC-26196 (без жирной кислоты), с добавлением 200 мкМ линолевой кислоты или с добавлением 200 мкМ линолевой кислоты с добавлением 20 мкМ SC-26196 ( «D6D inh.»). Монослои инфицировали Т . gondii брадизоитов ME49, выделенных из мозга мышей с хронической инфекцией при MOI 1:10.Через пять дней после заражения проводили окрашивание на GRA11B и BRP1 вместе с DAPI. Для каждого случайного поля подсчитывали количество ядер клетки-хозяина вместе с дважды положительными и отрицательными вакуолями GRA11B / BRP1. Для каждой биологической реплики было подсчитано три различных технических повтора, и представлено среднее значение. Каждая строка таблицы представляет собой независимый эксперимент, три биологические повторы. BRP1, брадизоит роптрийный белок-1; GRA11B, плотные гранулы белка 11B; MOI, множественность заражения.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.s007

(TIF)

S5 Данные. Исходные данные для рис. 5а.

Необработанные значения Ct стандартных кривых TUB1A, SAG1 и GRA11B в серии разведений геномной ДНК из тахизоитов и необработанные значения Ct TUB1A, SAG1 и GRA11B из кДНК гомогенизированных образцов подвздошной кишки мыши с использованием TUB1A в качестве нормализатора для мишени экспрессия гена. Лунки с несколькими температурами кривой плавления, указывающими на нецелевые продукты, были исключены («NA»).Образцы с пределом обнаружения ниже 40 циклов помечаются BDL. BRP1, брадизоит роптрийный белок-1; GRA11B, плотные гранулы белка 11B; SAG1, поверхностный антиген 1; ТУБ1А, тубулин 1А.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.s008

(TIF)

S6 Данные. Исходные данные для рис. 6а.

Необработанные значения Ct стандартной кривой SAG1 в серии разведений геномной ДНК с известным количеством паразитов и исходные значения Ct амплификации SAG1 из геномной ДНК неизвестных образцов фекалий с использованием введенного количества нг в качестве нормализатора. Лунки с несколькими температурами кривой плавления, указывающими на нецелевые продукты, были исключены («NA»). SAG1, поверхностный антиген 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.s009

(TIF)

S7 Данные. Исходные данные для рис. 6б.

Фекалии (0,5 г) солюбилизировали в 500 мкл физиологического раствора, а затем 10 мкл этой суспензии подсчитывали на гемоцитометре. Значения в таблице представляют собой количество ооцист на образец. Каждый столбец таблицы представляет собой независимый эксперимент, три биологических повтора.Среднее количество на d.p.i. были использованы для расчета количества ооцист / грамм кала. d.p.i., через день после заражения.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000364.s010

(TIF)

Благодарности

Мы искренне благодарим Джейсона Спенса и его лабораторию за помощь в культуре кишечных органоидов; Орелиен Дюметр, Адриан Хель и Джон Бутройд для специфических для кошачьих стадий антител; Марии Арендт за помощь в создании изображений патологии кишечника; Хизер Фриц, Дэвид Фергюсон и Жан-Франсуа Дюбремец за советом; Кристине Халл, Бенджамину Розенталю и Родни Уэлчу за редактирование рукописи.

Ссылки

1. 1. Дубей Дж. П., Миллер Н. Л., Френкель Дж. Ооциста Toxoplasma gondii из кошачьих фекалий. J Exp . Мед . 1970; 132: 636–662. pmid: 4927658
2. 2. Дубей Дж. П., Френкель Дж. Кисто-индуцированный токсоплазмоз у кошек. J Protozool 1972; 19: 155–177. pmid: 5008846
3. 3. Дабриц HA, Конрад PA. Кошки и Toxoplasma : значение для общественного здравоохранения. Здравоохранение по зоонозам .2010; 57: 34–52. pmid: 19744306
4. 4. Зулпо Д.Л., Самми А.С., Дос Сантос Дж. Р., Сассе Дж. П., Мартинс Т.А., Минутти А.Ф. и др., Toxoplasma gondii : исследование повторного выделения ооцист у домашних кошек. Ветеринар-паразитол . 2018; 249: 17–20. pmid: 29279081
5. 5. Дубей JP. Токсоплазмоз животных и человека. 2-е изд. Бока-Ратон, Флорида: CRC Press; 2010. С. 1–313.
6. 6. Рамакришнан С., Уокер Р. А., Эйхенбергер М., Хел А.Б., Смит, штат Северная Каролина. Мерозоит-специфический белок, TgGRA11B, идентифицированный как компонент паразитофорной вакуоли Toxoplasma gondii в модели экспрессии тахизоитов. Инт Дж Паразит . 2017; 47: 597–600.
7. 7. Шварц Дж. А., Фаутс А. Е., Каммингс, Калифорния, Фергюсон Д. Д., Бутройд Дж. Новый белок rhoptry в брадизоитах и ​​мерозоитах Toxoplasma gondii . Мол . Биохим . Паразитол . 2005. 144: 159–66. pmid: 16182390
8. 8. Нолан С.Дж., Романо Д.Д., Коппенс I. Капельки липидов хозяина: важный источник липидов, спасаемых внутриклеточным паразитом Toxoplasma gondii . Путь PLoS . 2017; 13: e1006362.
9. 9. Браун Ш., Зарновски Р., Шарпи В. К., Келлер Н. П.. Морфологические переходы, определяемые плотностной зависимостью и активностью липоксигеназы, у Aspergillus flavus . Appl Environ Microbiol . 2008. 74: 185674–5685.
10. 10. Уокер Р.А., Шарман П.А., Миллер С.М., Липпунер С., Оконевски М., Эйхенбергер Р.М. и др. Анализ РНК Seq транскриптома гаметоцитов Eimeria tenella раскрывает ключ к разгадке молекулярной основы полового размножения и биогенеза ооцист. BMC Genomics . 2015; 16: 1–20.
11. 11. Dumètre A, Dardé ML. Иммуномагнитное разделение ооцист Toxoplasma gondii с использованием моноклональных антител, направленных против стенки ооцисты. Дж. Микробиологические методы . 2005; 61: 209–17. pmid: 15722147
12. 12. Hehl A, Basso WU, Lippuner C, Ramakrishnan C, Okoniewski M, Walker RA и др. Бесполая экспансия мерозоитов Toxoplasma gondii отличается от тахизоитов и влечет за собой экспрессию неперекрывающихся семейств генов для прикрепления, вторжения и репликации в энтероцитах кошек. BMC Genomics 2015; 16: 66 pmid: 25757795
13. 13. Реки JPW, Синклер AJ, Кроуфорд Массачусетс. Неспособность кошки обесцвечивать незаменимые жирные кислоты. Природа . 1975. 258: 171–173. pmid: 1186900
14. 14. Синклер AJ, Маклин JG, Monger EA. Метаболизм линолевой кислоты у кошек. Липиды . 1979; 14: 932–936. pmid: 513981
15. 15. Макдональд М.Л., Роджерс К.Р., Моррис Дж. Г., Роль линолеата как незаменимой жирной кислоты для кошек, не зависящей от синтеза арахидоната. Журнал питания . 1983; 113: 1422–1433. pmid: 6408230
16. 16. Trevizan L, de Mello Kessler A, Brenna JT, Lawrence P, Waldron MK, Bauer JE. Поддержание уровня арахидоновой кислоты и свидетельство десатурации Δ5 у кошек, получавших рационы, обогащенные гамма-линоленовой и линолевой кислотой. Липиды . 2012; 47: 413–23. pmid: 22249937
17. 17. Холл диджей, Фриман Л. М., Раш Д. Е., Каннингем С. М.. Сравнение сывороточных концентраций жирных кислот у кошек с гипертрофической кардиомиопатией и здоровых животных. J Feline Med Surg . 2013; 16: 631–6. pmid: 24366844
18. 18. Фудзивара М., Мори Н., Сато Т., Тазаки Х., Исикава С., Ямамото И. и др. Изменения состава жирных кислот в тканях и сыворотке кошек с ожирением, получавших диету с высоким содержанием жиров. BMC Vet Res . 2015; 11: 1–8.
19. 19. Наварро, доктор медицины, Хортелано П., Периаго Д.Л., Пита М.Л. Влияние диетического оливкового и подсолнечного масел на липидный состав аорты и тромбоцитов, а также на эйкозаноиды крови у крыс. Артериосклер Тромб .1992; 12: 830–5. pmid: 1616908
20. 20. Адан Ю., Сибата К., Ни В., Цуда Ю., Сато М., Икеда И. и др., Концентрация липидов сыворотки и размер поражения аорты у самок и самцов мышей с дефицитом апо E, получавших докозагексаеновую кислоту. Biosci Biotechnol Biochem . 1999; 6: 309–13.
21. 21. Сато М., Сибата К., Номура Р., Кавамото Д., Нагамин Р., Имаидзуми К. Жиры, богатые линолевой кислотой, уменьшают развитие атеросклероза, не считая его эффекта увеличения окислительного и воспалительного стресса у мышей с дефицитом аполипопротеина Е по сравнению с жирами, богатыми насыщенными жирными кислотами . Br J Nutr . 2005; 94: 896–901. pmid: 16351765
22. 22. Jelińska M, Białek A, Gielecińska I, Mojska H, ​​Tokarz A. Влияние конъюгированной линолевой кислоты, вводимой крысам до и после канцерогенного агента, на метаболиты арахидоновой и линолевой кислоты в сыворотке и опухолях. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids . 2017; 126: 1–8. pmid: 2

    86

23. 23. Obukowicz MG, Welsch DJ, Salsgiver WJ, Martin-Berger CL, Chinn KS, Duffin KL и др., Novel, селективные ингибиторы десатуразы D6 или D5 жирных кислот в качестве противовоспалительных агентов у мышей. J Pharm Exp Therap . 1998. 287: 157–166.
24. 24. He C, Qu X, Wan J, Rong R, Huang L, Cai C. et al. Ингибирование активности дельта-6-десатуразы подавляет рост опухоли у мышей. PLoS ONE . 2012; 7: e47567. pmid: 23112819
25. 25. Guiton PS, Sagawa JM, Fritz HM, Boothroyd JC. Модель in vitro кишечной инфекции выявляет регулируемый в процессе развития транскриптом Toxoplasma sporozoites и сигнатуру, подобную NF-κB, в инфицированных клетках-хозяевах. PLoS ONE . 2017; 12: e073018.
26. 26. Бург Дж. Л., Перельман Д., Каспер Л. Х., Вэр ПЛ, Бутройд Дж. Молекулярный анализ гена, кодирующего основной поверхностный антиген Toxoplasma gondii . Дж. Иммунол . 1988; 141: 3584–3591. pmid: 3183382
27. 27. Дубей Дж. П., Френкель Дж. Кисто-индуцированный токсоплазмоз у кошек. Дж . Протозоол . 1972; 19: 155–177. pmid: 5008846
28. 28. Бутройд Дж. С., Блэк М, Боннефой С, Хель А, Нолл Л. Дж., Ясли ID.и др. Генетический и биохимический анализ развития Toxoplasma gondii . Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci . 1997; 352: 1347–1354. pmid: 9355126
29. 29. Дубей Дж. П., Феррейра Л. Р., Мартинс Дж., Джонс Дж. Л.. Споруляция и выживаемость ооцист Toxoplasma gondii в различных типах коммерческого туалета для кошек. Дж Паразитол . 2011; 97: 751–4. pmid: 21539466
30. 30. Белли С.И. , Уоллах М.Г., Люксфорд К., Дэвис М.Дж., Смит Северная Каролина.Роль богатых тирозином гликопротеинов-предшественников и сшивки опосредованных дитирозином и 3,4-дигидроксифенилаланином белков в развитии стенки ооцисты кокцидиевого паразита Eimeria maxima . Эукар Сотовый . 2003; 2: 456–464.
31. 31. Шамседдин Дж., Ахлаги Л., Размджоу Э., Шоджаи С., Монавари С.Х., Таджикский Нью-Джерси. и др., Конъюгированная линолевая кислота стимулирует апоптоз у RH и тегеранских штаммов Toxoplasma gondii in vitro. Иранский J Parasitol .2015; 10: 238–244.
32. 32. Толедо ДАМ, Д’Авила H, Мело RCN. Липидные тела хозяина как платформы для внутриклеточного выживания простейших паразитов. Передний . Иммунол . 2016; 7: 1–6.
33. 33. Lujan HD, Mowatt MR, Берд LG, Nash TE. Голодание по холестерину вызывает дифференциацию кишечного паразита Giardia lamblia . Proc . Нац. . Акад. . Sci . 1996; 93: 7628–33. pmid: 8755526
34. 34.Мунера Дж.О., Сундарам Н., Рэнкин С.А., Хилл Д., Уотсон С., Маэ М. и др., Дифференциация плюрипотентных стволовых клеток человека в органоиды толстой кишки посредством временной активации передачи сигналов BMP. Стволовая клетка . 2017; 21: 51–64. pmid: 28648364
35. 35. Zou WY, Blutt SE, Crawford SE, Ettayebi K, Zeng XL, Saxena K, Ramani S, Karandikar UC, Zachos NC, Estes MK. Кишечные энтероиды человека: новые модели для изучения желудочно-кишечных вирусных инфекций. Методы Мол Биол .Epub 2017 31 марта. Pmid: 28361480
36. 36. Питтман К.Дж., Сервантес П.В., Нолл Л.Дж. Z-ДНК-связывающий белок опосредует контроль хозяина инфекцией Toxoplasma gondii . Инфекция иммунной . 2016; 84: 3063–70. pmid: 27481249
37. 37. Pfaffl MW. Новая математическая модель для относительной количественной оценки в RT-PCR в реальном времени. Nucleic Acids Res . 2001; 29: 2002–2007.

Пищевые жирные кислоты и их влияние на репродуктивную функцию

На протяжении многих лет у меня была возможность работать с многочисленными молочными заводами в США и оказывать им техническую поддержку.С. и в международном масштабе. Один из наиболее часто задаваемых вопросов касается жиров при кормлении, их источников и ожидаемого воздействия на объем молока, его компоненты и воспроизводство.

Жиры давно скармливаются дойным коровам для увеличения энергетической плотности рациона и, следовательно, увеличения объема молока. В последнее время акцент сместился на кормление более специфическими незаменимыми жирными кислотами для модификации производства компонентов. В связи с этим еще одной областью внимания было возможное влияние кормления незаменимыми жирными кислотами на репродуктивную функцию.

Это выходит за рамки улучшения энергетического баланса и изменяет поставку компонентов жирных кислот, которые, как было показано, обеспечивают основные молекулярные компоненты для репродуктивных гормонов, особенно прогестерона. Исследования и последующий метаанализ выявили ответы, которые включают, но не ограничиваются:

1. Начало овуляции
2. Возобновление цикла
3. Улучшение видимых признаков течки
4. Увеличение притока крови к яичникам для стимулирования роста фолликулов

На эти ответы в значительной степени влияют простагландины (PG), наиболее известным из которых является простагландин F-2 альфа (PGF2α).Производство PG — это многоступенчатый процесс, который обычно начинается с синтеза холестерина из полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК).

Одним из наиболее известных из них является линолевая кислота (18: 2). Физиологическая основа, с помощью которой линолевая кислота может улучшать репродуктивную функцию, заключается в ее влиянии на метаболизм прогестерона.

Прогестерон, синтезируемый и секретируемый желтым телом яичника, не только подготавливает матку к имплантации эмбриона, но также помогает поддерживать беременность, обеспечивая питание тканям плода. Повышенные концентрации прогестерона в плазме были связаны с улучшением показателей оплодотворения у лактирующих молочных коров.

Дополнительные исследования показали, что у молочных коров, получавших дополнительный жир (жир, кальциевые соли длинноцепочечных жирных кислот [Ca-LCFA], приллированные жирные кислоты, цельные семена хлопка и т. Д.), Были повышенные концентрации прогестерона в крови.

Последовательность производства, начиная с ПНЖК, выглядит следующим образом:

ПНЖК -> Холестерин -> Прегненолон -> Прогестерон -> Тестостерон -> Эстрадиол -> Секреция лютеинизирующего гормона

Конечно, этот путь более сложен, чем эта иллюстрация, и включает как положительные, так и отрицательные компоненты обратной связи.Этот путь, в общем, иллюстрирует роль жирных кислот в этом процессе в качестве начального строительного блока. В целом, это помогает нам увидеть, что улучшение пищевых уровней определенных жирных кислот может иметь прямое влияние на выработку критически важных стероидных гормонов и, таким образом, может усиливать различные процессы, участвующие в воспроизводстве.

Это сложно

Текущие исследования показали, что изменение уровней жиров и определенных незаменимых жирных кислот (EFA) в рационе может иметь прямое влияние на различные репродуктивные процессы.Однако в процессе кормления есть несколько проблем.

С пищей животному можно доставлять большое количество жирных кислот. Хотя анализы могут определить профиль жирных кислот данного кормового ингредиента, добавки или добавки, способность передавать эти источники жира через рубец, не подвергаясь воздействию микробов, часто невозможна или, в лучшем случае, сильно варьируется. Другими словами, в зависимости от источника жирные кислоты, которые мы кормим, могут измениться к тому времени, когда они пройдут через рубец.

Примером этого является кормление некоторыми растительными ингредиентами (маслами), которые являются источниками ПНЖК. Как было показано ранее, ПНЖК являются предшественниками различных простагландинов. Проблема в следующем: мы можем кормить источники ПНЖК, но действие бактерий рубца может «био-гидрогенизировать» эти жирные кислоты.

Это превращает их в мононенасыщенные или полностью насыщенные жирные кислоты (стеариновая кислота, 18: 0), которые менее абсорбируются и, возможно, хуже используются.

Используя профили жирных кислот ингредиентов, мы можем составить диеты, специфичные для жирных кислот, вызывающих озабоченность, или тех, которые, как было показано, обеспечивают наибольшую реакцию у животных.Используя эти значения, можно увеличить количество EFA, таких как линолевая кислота (18: 2). Исследования показали положительное влияние на репродуктивную функцию кормления с улучшенным соотношением сторон 18: 2. В 2009 году исследователи представили обзор некоторых из этих испытаний. Эти результаты включали:

1. В нескольких исследованиях кормящие коровы, получавшие базовый рацион, содержащий цельные семена хлопчатника (около 9 процентов C18: 2) и дополнительно обогащенный Ca-LCFA (около 8 процентов C18: 2), демонстрировали лучшие показатели зачатия или беременности, чем коровы. кормили диетой, содержащей только цельные семена хлопка.

2. Дойные коровы, которых кормили жиром (4,3 процента C18: 2) с 3 процентами диетического сухого вещества, как правило, имели более высокий уровень оплодотворения на 98 дней в молоке, чем коровы, не получавшие жир.

3. У пасущихся молочных коров с добавлением соапстока соевого масла (53 процента C18: 2) примерно с 2 процентами сухого вещества рациона наблюдался более высокий уровень стельности, чем у контрольной группы (62,5 против 22,2 процента).

4. Говяжьи телки также испытали более высокие показатели беременности (94, 90, 91 и 79 процентов) из-за того, что их скармливали скрученными и треснувшими семенами сафлора, соевыми бобами или семенами подсолнечника, все с высоким содержанием C18: 2.

5. Защита лущеных семян хлопчатника (около 9 процентов линолевой кислоты) белково-альдегидными комплексами доставляет примерно 175 граммов линолевой кислоты в день в нижнюю часть кишечника лактирующих коров герефордской породы. Общие показатели беременности повысились с 63 до 79 процентов.

Это одни из наиболее очевидных и измеримых эффектов. Было обнаружено, что НЖК действуют и в других конкретных областях, которые в конечном итоге способствуют улучшению репродуктивной функции.

• Иммунный ответ. Есть взаимосвязь с функцией иммунной системы и восстановлением матки в послеродовом периоде. Репродуктивный тракт, а также иммунная система используют EFA для передачи сигналов, химической маркировки и предшественников ферментативной и гормональной активности. В матке функция EFAs является результатом включения этих жиров в мембраны клеток эндометрия для преобразования в PG.
• Плацентарные эффекты. Было показано, что плацента интегрирует НЖК преимущественно в клеточные мембраны, тем самым повышая активность и эффективность нескольких метаболических путей, изменяя гормональные профили, продуцируемые плодными оболочками, и способствуя снижению частоты задержек плодных оболочек в послеродовом периоде. Было обнаружено, что это напрямую связано с предпочтительным использованием линолевой кислоты, а также с концентрацией и долей НЖК в рационе.
• EFAs в раннем послеродовом периоде. Поскольку EFA являются предшественниками стероидов и PG, они связаны с восстановлением цикличности после отела. Было показано, что повышенный уровень линолевой и линоленовой кислот в рационе питания удваивает частоту овуляций к 30 дням после родов. Это также способствовало почти полному дополнительному циклу и значительному улучшению здоровья матки к 60 дням.Было показано, что эти ответы сокращают количество услуг в расчете на зачатие и количество дней работы.
• Распознавание и поддержание беременности. Распознавание стельности у коров обычно происходит между 15 и 18 днями после течки. По оценкам, до 40 процентов гибели эмбрионов происходит в период с 8 по 17 день после течки, в основном из-за неспособности поддерживать желтое тело за счет деятельности концептусов.

  Имеются данные, указывающие на то, что длина концепта напрямую связана с производительностью интерферона-тау. Включение омега-3 ПНЖК (то есть линоленовой кислоты) в рацион через Ca-LCFA увеличивает длину концептуальной части, что должно улучшить синтез интерферона-тау. Это увеличивает вероятность распознавания беременности за счет поддержания желтого тела.

Исследования и практика проясняют необходимость кормления коров дополнительными жирами и, в частности, НЖК, не только для повышения плотности энергии. Незаменимые жирные кислоты, в частности линолевая и линоленовая кислоты, оказывают непосредственное влияние на физиологические процессы, такие как целостность клеточной мембраны, гормональные пути и иммунную функцию.

Очевидно, что они важны для здоровья матки, и это сопровождается более ранними послеродовыми овуляциями и большим количеством циклов в период добровольного ожидания. Эти события приводят к улучшению фертильности на более раннем этапе послеродового периода, поскольку они сокращают количество услуг в расчете на зачатие и количество открытых дней.

Однако ключевой проблемой является необходимость определения фактических потребностей животного в определенных EFA. Обладая этой информацией, мы можем точно настроить состав рациона и повысить точность кормления для улучшения продуктивности и воспроизводства.

Для получения дополнительной информации, пожалуйста, посетите нас на Facebook по адресу Reveille Livestock Concepts.

Использование аминокислот для воспроизводства свиноматок.

Глава: 1 (Страница №: 1)	Аминокислоты как многофункциональные молекулы. Авторы): Д’Мелло, Дж.ПФ.
Раздел: 2 (Страница №: 15)	Аминокислотный анализ кормов. Авторы): Фонтейн, Дж.
Раздел: 3 (Страница №: 41)	Поглощение аминокислот и пептидов.Авторы): Крехбиль, К. Мэтьюз, Дж. К.
Раздел: 4 (Страница №: 71)	Схема путей метаболизма аминокислот.Авторы): Д’Мелло, Дж. П. Ф.
Раздел: 5 (Страница №: 87)	Метаболизм аминокислот у животных: обзор. Авторы): Бекетт, Б. Дж.
Раздел: 6 (Страница №: 103)	Соотношение незаменимых и заменимых аминокислот. Авторы): Хегер, Дж.
Раздел: 7 (Страница №: 125)	Неблагоприятное действие аминокислот. Авторы): Д’Мелло, Дж. П. Ф.
Глава: 8 (Страница № 143)	Метионин-цистиновые отношения в питании свиней. Авторы): Льюис, А. Дж.
Глава: 9 (Страница № 157)	Идеальный аминокислотный состав рациона для свиней. Авторы): Бойзен, С.
Глава: 10 (Страница №: 169)	Усвояемые аминокислоты в составе рациона для свиней. Авторы): Мозентин, Р.Радемахер, М.
Глава: 11 (Страница № 187)	Моделирование метаболизма аминокислот и оценка потребности в аминокислотах. Авторы): Моуган, П.Дж. Фуллер, М.Ф.
Глава 13 (Страница № 223)	Идеальный аминокислотный состав для цыплят-бройлеров. Авторы): Бейкер, Д.ЧАС.
Глава 14 (Страница № 237)	Ответы растущей птицы на аминокислоты. Авторы): Д’Мелло, Дж. П.Ф.
Раздел: 15 (Страница №: 265)	Метаболизм и de novo синтез аминокислот микробами рубца. Авторы): Аташоглу, Ч.Уоллес, Р. Дж.
Глава 16 (Страница № 291)	Моделирование метаболизма аминокислот у жвачных животных. Авторы): Болдуин, Р.Л. Калверт, К. Робинсон, П. Х. Джонсон, Х.А.
Глава 17 (Страница № 309)	Использование аминокислот в производстве шерсти.Авторы): Лю, С.М. Мастерс, Д.
Глава 18 (Страница № 329)	Утилизация аминокислот при выращивании и откорме жвачных животных. Авторы): Титгемейер, Э.
Глава 19 (Страница № 347)	Поглощение и метаболизм аминокислот молочными железами кормящими жвачими животными.Авторы): Бекетт, Б. Дж. Ханиган, М.Д. Лапьер, Х.
Глава 20 (Страница № 367)	Влияние аминокислот на молочную продуктивность. Авторы): Чемберлен, Д. Йео, Дж. М.
Глава 21 (Страница № 389)	Прогнозирование адекватности аминокислот в рационе жвачных животных.Авторы): Фокс, Д. Г. Тедески, Л.О.
Глава 22 (Страница № 411)	Потребности собак и кошек в аминокислотах для различных физиологических функций.Авторы): Хендрикс, В. Х.
Глава 23 (Страница № 427)	Потребности рыб и ракообразных в аминокислотах.Авторы): Уилсон, Р. П.
Раздел: 24 (Страница №: 449)	Кристаллические аминокислоты и выбросы азота. Авторы): Верстеген, М.В. А. Jongbloed, A. W.
Глава: 25 (Страница № 459)	Экономическая оценка аминокислотного ответа у растущей птицы. Авторы): Пак, М.Хелер, Д. Лемме, А.
Глава: 26 (Страница №: 485)	Выводы.Авторы): Д’Мелло, Дж. П. Ф.

Журнал профессиональной и экологической медицины

Что вы по профессии? Academic MedicineAcute Уход NursingAddiction MedicineAdministrationAdvanced Практика NursingAllergy и ImmunologyAllied здоровьеАльтернативная и комплементарной MedicineAnesthesiologyAnesthesiology NursingAudiology & Ear и HearingBasic ScienceCardiologyCardiothoracic SurgeryCardiovascular NursingCardiovascular SurgeryChild NeurologyChild PsychiatryChiropracticsClinical SciencesColorectal SurgeryCommunity HealthCritical CareCritical Уход NursingDentistryDermatologyEmergency MedicineEmergency NursingEndocrinologyEndoncrinologyForensic MedicineGastroenterologyGeneral SurgeryGeneticsGeriatricsGynecologic OncologyHand SurgeryHead & Neck SurgeryHematology / OncologyHospice & Паллиативная CareHospital MedicineInfectious DiseaseInfusion Сестринское делоВнутренняя / общая медицинаВнутренняя / лечебная ординатураБиблиотечное обслуживание Материнское обслуживание ребенкаМедицинская онкологияМедицинские исследованияНеонатальный / перинатальный неонатальный / перинатальный уходНефрологияНеврологияНейрохирургияМедицинско-административный уходNursing-all Sp ecialtiesNursing-educationNutrition & DieteticsObstetrics & GynecologyObstetrics & Gynecology NursingOccupational & Environmental MedicineOncology NursingOncology SurgeryOphthalmology / OptometryOral и челюстно SurgeryOrthopedic NursingOrthopedics / Позвоночник / Спорт Медицина SurgeryOtolaryngologyPain MedicinePathologyPediatric SurgeryPediatricsPharmacologyPharmacyPhysical Медицина и RehabilitationPhysical Терапия и женщин Здоровье Физическое TherapyPlastic SurgeryPodiatary-generalPodiatry-generalPrimary Уход / Семейная медицина / Общие PracticePsychiatric Сестринское делоПсихиатрияПсихологияОбщественное здравоохранениеПульмонологияРадиационная онкология / ТерапияРадиологияРевматологияНавыки и процедурыСонотерапияСпорт и упражнения / Тренировки / ФитнесСпортивная медицинаХирургический уходПереходный уходТрансплантационная хирургияТерапия травмТравматическая хирургияУрологияЖенское здоровьеУход за ранамиДругое

Что ваша специальность? Addiction MedicineAllergy & Clinical ImmunologyAnesthesiologyAudiology & Speech-Language PathologyCardiologyCardiothoracic SurgeryCritical Уход MedicineDentistry, Oral Surgery & MedicineDermatologyDermatologic SurgeryEmergency MedicineEndocrinology & MetabolismFamily или General PracticeGastroenterology & HepatologyGenetic MedicineGeriatrics & GerontologyHematologyHospitalistImmunologyInfectious DiseasesInternal MedicineLegal / Forensic MedicineNephrologyNeurologyNeurosurgeryNursingNutrition & DieteticsObstetrics & GynecologyOncologyOphthalmologyOrthopedicsOtorhinolaryngologyPain ManagementPathologyPediatricsPlastic / Восстановительная SugeryPharmacology & PharmacyPhysiologyPsychiatryPsychologyPublic, Окружающая среда и гигиена трудаРадиология, ядерная медицина и медицинская визуализацияФизическая медицина и реабилитация Респираторная / легочная медицинаРевматологияСпортивная медицина / наукаХирургия (общая) Травматологическая хирургияТоксикологияТрансплантационная хирургияУрологияСосудистая хирургияВироло у меня нет медицинской специальности

Где вы работаете? Больница на 250 коекБольница на более 250 коекУправление престарелыми или хоспис Психиатрическое или реабилитационное учреждениеЧастная практикаГрупповая практикаКорпорация (фармацевтика, биотехнология, инженерия и т. Д.) Докторантура Университета или Медицинского факультета Магистратура или 4-летнего Академического Университета Колледж Сообщества Правительство Другое

Качество аминокислот изменяет количественную доступность белка для размножения у Drosophila melanogaster

Abstract

Хорошо известно, что состав рациона, особенно относительное содержание основных макроэлементов, влияет на благополучие животных, изменяя репродуктивную способность, метаболизм и продолжительность жизни.Однако меньше внимания уделялось тому, как качество этих питательных веществ влияет на взаимодействие макронутриентов. Пищевую геометрию можно использовать для моделирования влияния нескольких диетических компонентов на характеристики жизненного цикла и для сравнения этих реакций при различном качестве диеты. Предыдущие исследования показали, что качество диетического белка может быть повышено для производства яиц у Drosophila melanogaster путем согласования пропорций пищевых аминокислот с балансом аминокислот, используемых суммой белков в транслированном экзоме in silico мухи.Здесь мы показываем, что качество диетического белка резко меняет влияние количества белка на репродуктивную функцию самок в широком диапазоне диет, различающихся как по содержанию белка, так и по концентрации углеводов. Эти данные показывают, что когда источники ингредиентов различаются, их относительная ценность для потребителя может сильно различаться и давать очень разные физиологические результаты. Такие вариации могут быть особенно важны для метаанализа, который пытается сделать обобщающие выводы из различных исследований.

Введение

Чтобы оптимизировать приспособленность, организмы должны потреблять питательные вещества достаточного качества и в количестве, достаточном для удовлетворения своих потребностей (Hall et al., 2008, Lee et al., 2008, Bong et al., 2014). Об этом свидетельствуют драматические изменения репродуктивной функции, наблюдаемые, когда мух или грызунов подвергаются ограничению в пище или изменению рациона, особенно при изменении относительного соотношения белков к углеводам (Widdowson and Cowen, 1972, Good and Tatar, 2001, Carey et al., 2002, Liang and Zhang, 2006, Lee et al., 2008, Skorupa et al., 2008, Simpson and Raubenheimer, 2012, Solon-Biet et al., 2015, Camus et al., 2019).

Еда состоит из десятков питательных веществ, которые взаимодействуют, изменяя физиологию животных.Понимание того, как пищевые взаимодействия влияют на потребителя, сложно, но может быть облегчено с помощью структурированного подхода, такого как диетическая геометрия (Raubenheimer and Simpson, 1997). Пищевая геометрия отображает реакцию жизненных особенностей на количественные изменения двух или более макроэлементов. Обычно это выполняется путем введения животных в один из множества рационов, которые варьируются в зависимости от диапазона калорийности и соотношения белков и углеводов. Пространство питательных веществ определяется осями (обычно двумя), которые представляют количество питательных веществ, которые организм съел — таким образом, любая точка в пространстве может представлять состояние организма в соответствии с его историей питания.Путем сопоставления множества организмов с разными диетами в этом пространстве, их коллективные фенотипические реакции могут быть подогнаны наложенной поверхностью, представленной тепловой картой ( z -ось). Это позволяет моделировать интерактивное воздействие питательных веществ на интересующие фенотипы. Хотя концептуально просто, оценка фенотипических реакций на питание с точки зрения геометрии питания выявила новое понимание биологии и, в некоторых случаях, объединила очевидно противоречивые интерпретации того, как организмы реагируют на изменение диеты (Solon-Biet et al., 2016).

Эксперименты по питательной геометрии показали, что изменение двух энергосберегающих макроэлементов, белка и углеводов, влияет на проявление многих черт. В частности, продолжительность жизни и размножение взрослых плодовых мух ( Drosophila melanogaster ) формируется за счет интерактивного воздействия пищевых белков и углеводов (Lee et al., 2008, Skorupa et al., 2008, Jensen et al., 2015). В случае белка более поздние исследования показали, что пропорция составляющих его аминокислот играет важную роль в влиянии белка на эти характеристики (Grandison et al., 2009, Piper et al., 2017).

Потребность самок мух в пище в аминокислотах для оптимального производства яиц может быть определена по их геному с помощью процесса, называемого соответствием экзома (Piper et al., 2017). Чтобы экзом соответствовал диете, мы in silico переводим экзом потребителя, суммируем содержание каждой аминокислоты во всех белках и находим относительную долю каждой аминокислоты. Затем мы используем эту пропорцию как основу для определения содержания каждой аминокислоты в пище. Сопоставив таким образом качество пищевого белка с экзомом мухи, мы обнаружили, что при фиксированной массе аминокислот диеты, согласованные с экзомами, поддерживают более высокие уровни воспроизводства, чем диеты, которые не соответствуют друг другу (Piper et al., 2017). Вместе эти данные показывают, что аминокислотный баланс в рационе важен для определения результатов фитнеса.

Хотя диетический аминокислотный баланс важен, эксперименты с диетической геометрией, которые измеряют фитнес-реакцию на диету, неизменно рассматривают белок как единый элемент питания с фиксированной пропорцией всех 20 аминокислот. Это разумно для экспериментов, в которых источник белка остается постоянным во всех диетах. Однако белки различаются по качеству, если их получают из разных источников, и, как и многие натуральные ингредиенты, один и тот же тип белка может отличаться по качеству в зависимости от места и сезона.Учитывая это, может быть трудно напрямую сравнивать влияние потребляемого «белка» на признак, когда данные взяты из разных исследований. Чтобы изучить эти эффекты, мы разработали эксперимент, используя схему питательной геометрии, чтобы оценить, как изменение качества пищевого белка изменяет интерактивные эффекты соотношения аминокислоты (белок; Р) к углеводам (С) на откладывание яиц. Мы разработали ряд диет, различающихся соотношением P: C для каждой из двух различных смесей аминокислот (белков). Эти смеси различались по относительной пропорции каждой аминокислоты, а также по идентичности наиболее ограничивающей незаменимой аминокислоты и степени, в которой она, как предполагается, будет ограничивающей.

Метод

Животноводство

Мы использовали дагомейскую беспородную популяцию Drosophila melanogaster (Mair et al., 2005). При регулярном выращивании и содержании мух использовались методы и сахарно-дрожжевой (SY) рацион, описанные у Bass et al. (2007). Всех мух поддерживали при 25 ° C с фотопериодом 12 часов: 12 часов света и темноты. Для эксперимента популяция мух была синхронизирована по возрасту, как в Piper and Partridge (2016).

Экспериментальные диеты

Полностью определенные синтетические (холидные) диеты были составлены в соответствии с Piper et al.(2014), в которых свободные аминокислоты используются для создания белковых эквивалентов. Чтобы преобразовать аминокислоты в белковые эквиваленты, мы использовали молярные количества азота и предположили, что N составляет 16% всех белков (Sosulski and Imafidon, 1990). Сравнивали два качества белка, определяемые их соотношением аминокислот: FLYaa (соответствует соотношению аминокислот экзома взрослых мух) и MMaa (соотношение считается несовместимым с потребностями мух). Относительная пропорция каждой аминокислоты в каждом соотношении аминокислот показана в таблице 1.С этого момента концентрация всех аминокислот, называемая белком (P), рассчитывается в соответствии с вышеуказанным методом.

Относительные пропорции каждой аминокислоты в двух тестируемых аминокислотных соотношениях, FLYaa и MMaa.

Для обоих соотношений аминокислот мы разработали рационы с одним из пяти соотношений P: C (1: 3,6, 1: 1,8, 1: 1,1, 1: 0,8, 1: 0,6) и одной из четырех калорийных плотностей (66,8 ккал. / Л, 111,3 ккал / л, 155,8 ккал / л, 200,3 ккал / л), где плотность калорийности пищи была оценена расчетным путем с использованием значения 4 ккал / г как для белка, так и для углеводов (таблица 2).Таким образом, для проверки влияния на яйценоскость каждого соотношения аминокислот использовали 20 диет.

Эквивалентное соотношение белок: углевод (P: C), отображаемое вместе с плотностями питательных веществ.

Производство яиц для каждого соотношения аминокислот (FLYaa и MMaa) моделировали с использованием линейных предикторов для белка (P) и углеводов (C) и их взаимодействия (P x C). Поскольку данные кажутся нелинейными, мы также оценили квадратичные члены для белка (P ² ) и углеводов (C ² ).Сообщается о минимальных адекватных моделях. β указывает оценку наклона для каждой переменной, и; SE, стандартная ошибка. Выделение жирным шрифтом означает значимость, * p <0,05; ** p <0,001.

Экспериментальная установка

Мух помещали в устройства, называемые dFlats, которые состоят из блока Perspex с пробуренными в них 12 скважинами, так что пробуренные скважины имеют объем, такой же, как стандартные флаконы для мух (FS32, Pathtech) и их расположение таково, что 12 отверстий соответствуют положению лунок в 12-луночном планшете (в соответствии с дизайном: https: // www.flidea.tech/proiects). В каждую лунку 12-луночного планшета добавляли 3 мл корма. Каждая лунка dFlat содержала 10 спарившихся самок мух, и мы поддерживали одну dFlat для каждого из 20 холидических экспериментальных рационов (12 повторяющихся лунок x 10 мух = 120 мух на рацион).

Эксперимент по воспроизводству

Один раз в неделю в течение 3 недель подсчитывали и регистрировали количество яиц, отложенных на питательную среду за 18-часовой период. Измерение продуктивности размножения в течение первых недель кладки яиц показало, что репродуктивная функция мух сохраняется в течение всей жизни (Chapman and Partridge, 1996, Muller et al., 2001). Для каждой лунки в каждом устройстве dFlat рассчитывали количество яиц, отложенных на одну самку в каждый экспериментальный день (день 8, 15 и 22). Значение яиц, отложенных средней самкой в ​​колодце, суммировалось по дням и использовалось для расчета кумулятивной кладки яиц средней самкой в ​​зависимости от типа пищи. Мы называем это значение показателем воспроизводства. Количество яиц в каждой лунке и тип пищи были получены путем получения изображений с помощью веб-камеры, прикрепленной к стереомикроскопу. Затем изображения были обработаны в Image J для получения правильного размера изображения, которые затем автоматически подсчитывались в программном обеспечении QuantiFly (Waithe et al., 2015).

Статистический анализ

Все анализы проводились с использованием R (версия 3.3.0, доступная на http://www.R-project.org/). Чтобы проанализировать взаимосвязь между нашим индексом воспроизводства и концентрацией белка (P) и углеводов (C), мы создали отдельные поверхности отклика для каждого из двух соотношений аминокислот. Каждая поверхность была оценена с использованием многомерной полиномиальной регрессии второго порядка, при этом линейные, квадратичные и перекрестные составляющие этой модели отражают линейные и нелинейные эффекты концентрации P и C на воспроизводство мух.Для каждого соотношения аминокислот была найдена минимальная адекватная модель для каждой линейной модели путем определения того, значительно ли уменьшило ли удаление наиболее сложного параметра соответствие модели. Мы визуализировали поверхность отклика каждого соотношения аминокислот, используя прогнозы, полученные из тонких пластинчатых шлицев из пакета полей (см. Www.github.com/NCAR/Fields), а затем визуализировали с помощью пакета ggplot.

Результаты

Чтобы уловить влияние различий в качестве белка на яйценоскость D.melanogaster, мы, , создали среду, содержащую два различных соотношения аминокислот, одна из которых, как известно, не соответствует требованиям к яйцекладке у мух (MMaa), а другая, как известно, точно соответствует экзому мухи (FLYaa) (Piper et al., 2017) . Для каждого соотношения аминокислот был протестирован набор из 5 различных соотношений P: C, каждое при 4 различных плотностях питательных веществ. Тонкопластинчатые шлицы использовали для визуализации поверхностей откладки яиц у мух, содержащихся на разных диетах (рис. 1А и 1В).

Кладка яиц зависит от количества углеводов, а также количества и качества белка. Мух содержали на диетах, содержащих аминокислоты в соотношении либо (A) FLYaa (соотношение аминокислот, совпадающих с экзомами мух), либо (B) MMaa (несоответствующее соотношение аминокислот). Черные точки представляют собой 20 индивидуальных диет, по которым оценивался индекс воспроизводства, а пунктирные линии представляют собой уровни питания фиксированного P: C.

Для всех типов корма мухи, соблюдающие диету MMaa, откладывают меньше яиц на самку в день, чем мухи, соблюдающие диету FLYaa (диета MMaa, 24.07 ± 1,42; ФЛЯа 31,69 ± 2,14; односторонний дисперсионный анализ: F _1,33 = 11,205, p <0,001). Для мух, соблюдающих диету MMaa и FLYaa, наблюдался значительный эффект линейного компонента белка, так что яйценоскость увеличивалась с увеличением концентрации белка в рационе (таблица 2). Для FLYaa мы также обнаружили, что квадратичный член для концентрации белка является значимым, что показано на графиках, поскольку пик кладки яиц в FLYaa произошел при промежуточных концентрациях белка (P: C = 1: 0.8) (рисунок 1а; таблица 2). С этого момента откладывание яиц снижалось по мере увеличения или уменьшения концентрации белка (рис. 1а; таблица 2). Напротив, пиковая кладка яиц на MMaa произошла на корме с самой высокой плотностью питательных веществ с соотношением P: C 1: 0,6. Не было обнаружено никакого заметного влияния концентрации углеводов на яйценоскость в продуктах с обоим соотношением аминокислот, а также не было обнаружено значительного взаимодействия между концентрацией углеводов и белка (Таблица 2). Эти результаты показывают, что для ряда тестируемых нами диет белок был основным фактором, определяющим яйценоскость, и что на грамм поставляемых аминокислот FLYaa поддерживал более высокие уровни яйценоскости, чем MMaa.

Обсуждение

Соотношение диетического белка и углеводов в рационе играет важную роль в определении воспроизводства у Drosophila melanogaster : диета с более высокой плотностью и более высоким соотношением P: C способствует более высокой яйценоскости самок (Mair et al., 2005, Lee et al., 2008, Skorupa et al., 2008, Jensen et al., 2015). Здесь мы показываем, что изменение качества протеина в рационе также может значительно изменить его биодоступность для воспроизводства самок D. melanogaster .Эти данные демонстрируют, насколько разные результаты по важным характеристикам физической формы могут иметь место при разном качестве пищевых ингредиентов.

Белок часто является ограничивающим компонентом рациона наземных животных (White, 1993), а это означает, что изменения качества потребляемого пищевого белка должны оказывать заметное влияние на приспособленность многих животных в различных условиях. Действительно, добавление в рацион диких хлопковых крыс и хлопчатобумажных кроликов незаменимой аминокислоты (метионина) может улучшить их репродуктивный успех и увеличить размер популяции (Lochmiller et al., 1995, Webb et al., 2005), поддерживая синие синицы на диете, дополненной аминокислотами, подходящими для образования яичного белка, откладывали больше яиц на кладку, чем те, которые получали несоответствующий баланс аминокислот (Ramsay and Houston, 1998). Точно так же самки веслоногих, питавшиеся диетой, содержащей профили незаменимых аминокислот, которые близко соответствовали составу тела самок, имели более высокий репродуктивный успех (Guisande et al., 1999) и, добавляя аминокислоты в рацион домашнего скота, такого как кабаны и куры, могли увеличивают репродуктивную продуктивность и дают больше мышечной массы (Dong et al., 2016, Cerrate et al., 2019). Наконец, недавняя работа в лаборатории на мухах и мышах показала, что различия в качестве белка, определяемые на уровне баланса незаменимых аминокислот, могут иметь драматические последствия для воспроизводства животных и их пищевого поведения (Leitao-Goncalves et al., 2017, Piper et al., 2017, Solon-Biet et al., 2019). Таким образом, изменение качества пищевого белка путем изменения пропорции аминокислот может иметь важное влияние на физическую форму как животных, выращиваемых в лаборатории, так и диких животных.

В наших экспериментальных диетах мы обнаружили большие изменения в яйценоскости, поскольку соотношение аминокислот было изменено так, что биодоступность источника азота изменилась в 2,5 раза (Piper et al., 2017). Другими словами, уровень FLYaa, необходимый для поддержания максимального выхода яиц, составлял ~ 15 г / л, что в 2,5 раза меньше количества MMaa (37 г / л), которое потребовалось бы для достижения такого же выхода. Таким образом, для оптимальной кладки яиц требуется меньшее количество высококачественной пищи. При определенных диетах это большое различие в качестве белка легко возникает, потому что каждой аминокислотой можно независимо управлять в широком диапазоне концентраций.Интересно, что столь же большие различия в относительном количестве аминокислот (то есть изменения в качестве белка) также могут быть обнаружены между натуральными белками в цельных продуктах. Например, сравнивая средние профили аминокислот по группам продуктов питания, опубликованные в отчете ФАО (Food Policy and Food Science Service, 1970), мы обнаружили, что для фиксированного количества белка средние пропорции аминокислот в мясе составляют ~ 2- в несколько раз более высокого качества, чем средний белок на основе бобовых. Это связано с тем, что ограничивающая незаменимая аминокислота в белке бобовых, метионин, более дефицитна по сравнению с ограничивающей незаменимой аминокислотой, лейцином, в мясном протеине.Таким образом, мы прогнозируем, что использование различных диетических компонентов для кормления животных или людей приведет к резким изменениям физиологии и поведения. Кроме того, без четкого знания источника ингредиентов и их качества будет сложно сделать обобщающие выводы из метаанализов, включающих различные исследования.

Важно отметить, что белок — не единственная ось соединений в большинстве опубликованных экспериментов по питательной геометрии. Например, другие макроэлементы, дающие энергию, углеводы и жиры, также существуют в виде разнообразных молекул в пище.Это может быть еще более сложным, поскольку в типичных исследованиях с мухами сахароза и дрожжи часто используются в качестве источников углерода и белка соответственно (Bass et al., 2007, Min et al., 2007, Lee et al., 2008), а дрожжи содержат различные типы углеводов, а также другие пищевые компоненты, такие как стерины, нуклеиновые кислоты, витамины и минералы (Lange and Heijnen, 2001). В дополнение к нашим выводам о качестве белка, другая работа показала, что изменение углеводного компонента диеты от сахарозы до фруктозы может изменить физиологию мух (Lushchak et al., 2014). Таким образом, в будущих исследованиях будет важно понять относительный вклад различных углеводов, жиров и других питательных веществ в изменение характеристик физической формы.

Заключение

Показывая, что точный аминокислотный состав пищевого белка является ключевым для определения женской плодовитости, мы демонстрируем необходимость предоставления дополнительной информации при маркировке композитных осей питания в экспериментах по питательной геометрии. В частности, белок должен быть маркирован с указанием его источника, чтобы указать его качество — показатель, который можно было бы улучшить, если бы наиболее ограничивающая незаменимая аминокислота была идентифицирована путем ссылки на аминокислотный профиль пищевого белка с in silico транслированный экзом потребителя. (Пайпер и др., 2017). Мы ожидаем, что это облегчит сопоставимость данных между исследованиями.

Благодарности

Мы благодарим Эми Дедман, Сашу Поллок и Сару Гоф за техническую помощь и Скотта Плетчера за помощь в проектировании и развитии гостиничных номеров. Мы также выражаем признательность за многие плодотворные дискуссии на семинарах по гомеостазу питания в Бонне.