Ralstonia solanacearum продуцирует лектин RS-IIL, кодируемый lecM , с высоким сходством последовательности с лектином PA-IIL Pseudomonas aeruginosa (Sudakevitz et al ., 2002, 2004). Расчетная аминокислотная последовательность показала, что RS-IIL имеет сигнальные пептиды на своем N-конце (Sudakevitz et al ., 2002, 2004). Неферментные белки в матриксе, такие как белки, связанные с клеточной поверхностью, и белки, связывающие внеклеточные углеводы, лектины, участвуют в формировании и стабилизации полисахаридной матричной сети и составляют связь между бактериальной поверхностью и EPS, образуя биопленки ( Флемминг и Вингендер, 2010). RS-IIL проявляет сродство к маннозе, фруктозе, фукозе, галактозе и арабинозе (Sudakevitz et al ., 2004).

Чтобы оценить участие lecM в колонизации межклеточных пространств OE1-1, листья 5-недельных растений томатов были инфильтрированы штаммами R. solanacearum в объеме 20 мкл при OD ₆₀₀ = 0,1. Популяция мутанта lecM (OE1‐1‐ lecM :: EZ‐ Tn 5) в инфильтрированных листьях была значительно меньше, чем популяция OE1‐1 и мутанта lecM , трансформированного нативным lecM ( Инжир.a, lecM ‐comp). Все растения томатов увяли через 10 дней после инокуляции штаммами OE1‐1 и lecM ‐comp (рис. А). Напротив, мутант lecM утратил вирулентность на растениях томата (рис. А).

Динамика популяций Ralstonia solanacearum штаммов OE1‐1, OE1‐1‐ lecM :: EZ‐ Tn 5 (мутант lecM ) и мутанта lecM , дополненного нативным lecM ( lecM ‐comp) в листьях (a) и корнях (b) растений томата, инокулированных путем инфильтрации листьев и окунания корней, соответственно.Звездочки указывают на значительное отличие от дикого типа ( P <0,05, t ‐test). КОЕ, колониеобразующая единица.

Вирулентность штаммов Ralstonia solanacearum на растениях томатов. Бактериальное увядание на 8-недельных растениях томатов, инокулированных инфильтрацией листьев (а) и окунанием корней (б) штаммами R. solanacearum OE1-1, OE1-1- lecM :: EZ- Tn 5 ( мутант lecM ) и мутант lecM , дополненный нативным lecM ( lecM ‐comp).Растения оценивали по следующей шкале индекса болезни: 0 — увядание отсутствует; Увядание 1,1–25%; 2, 26–50% увядание; 3, увядание 51–75%; 4, увядание 76–99%; 5, мертвый.

При инокулировании путем окунания корней популяция мутанта lecM в корнях была значительно ниже, чем у OE1-1 и lecM -comp (рис. B), а мутант lecM потерял свою вирулентность (рис. . б). lecM ‐comp восстановила свою вирулентность на растениях томатов, аналогичную OE1‐1.

Мутация

Ralstonia solanacearum образует биопленки как на абиотических, так и на биотических поверхностях (Kang et al ., 2002; Менг и др. , 2011; Яо и Аллен, 2006; Чжан и др. ., 2014). Во время образования биопленки клетки штамма OE1-1 сначала прикрепляются к поверхности, а затем образуют плоские микроколонии, а затем — биопленки грибовидного типа. Мы наблюдали прикрепляющуюся способность штаммов, инкубированных в жидкостях апопласта, под фазово-контрастным микроскопом. Клетки OE1‐1 прикрепляются к целлюлозным мембранам (рис. А), аналогично предметным стеклам (рис. Б). Присоединение мутанта lecM к предметным стеклам (рис.c) был значительно меньше, чем у OE1‐1 (рис. b) и lecM ‐comp (рис. d).

Присоединяемость и образование микроколоний штаммов Ralstonia solanacearum . Нитроцеллюлозные мембраны (2 × 2 см ² ), приготовленные из целлюлозных пробирок Visking (а) и предметных стекол (б – г), пропитывали суспензиями штаммов R. solanacearum OE1-1 (a, b), OE1-1 — lecM :: EZ- Tn 5 (мутант lecM , c) и мутант lecM , дополненный нативным lecM ( lecM -comp, d).

Мутация

Затем мы проанализировали образование биопленок штаммами R. solanacearum в апопластных жидкостях в лунках планшета ПВХ, окрашенных кристаллическим фиолетовым. Штаммы инкубировали в апопластных жидкостях в лунках микротитровального планшета из ПВХ в течение 24 ч (бактериальная плотность при OD ₆₀₀ = 0,8). В этих условиях мутант lecM продуцировал значительно меньше биопленок, чем OE1-1 и lecM -comp (рис.б).

Для анализа конфигурации биопленок, продуцируемых штаммами, их инкубировали в жидкостях апопласта на наноперколяторах в течение 24 часов (плотность бактерий при OD ₆₀₀ = 0,6). Конфигурации биопленок, продуцируемых штаммами в этих условиях, наблюдали с помощью SEM. Мутантные клетки lecM агрегировали значительно меньше, чем OE1-1 (рис. F), и давали незрелые биопленки (рис. G). Наблюдались биопленочные структуры грибовидного типа, продуцируемые lecM ‐comp (рис.час).

RS-IIL показывает сродство к сахарам в порядке d-манноза> d-фруктоза> l-фукоза> l-галактоза> d-арабиноза (Sudakevitz et al ., 2004). Кроме того, применение d-арабинозы, d-маннозы и d-фруктозы усиливало образование биопленок клетками OE1-1 (рис. A). Мы проанализировали образование биопленок lecM мутантных клеток в среде ¼ × M63, включая каждый из этих сахаров в концентрации 1,0%, в лунках планшета ПВХ, окрашенных кристаллическим фиолетовым. Никакое применение сахара не влияло на формирование биопленки мутантными клетками lecM (рис.б).

Экспрессия

Сообщалось, что экспрессия lecM положительно регулируется HrpG (Valls et al ., 2006). Однако формирование биопленки R. solanacearum зависит от функциональной PhcA, активируемой посредством определения кворума (Genin and Denny, 2012), а функциональная PhcA репрессирует экспрессию регулона hrp (Genin et al ., 2005; Yoshimochi ). et al ., 2009).Мы предположили, что, если lecM участвует в формировании биопленок, экспрессия lecM может зависеть не только от HrpG, но и от PhcA. Мы исследовали экспрессию lecM в штамме OE1-1, мутанте hrpG и удаленном мутанте phcA , выращенных в среде ¼ × M63 при OD ₆₀₀ = 0,01 и OD ₆₀₀ = 0,3 с использованием реальных количественные анализы обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (qRT-PCR). Экспрессия lecM в OE1-1 при OD ₆₀₀ = 0.01 был значительно ниже, чем при OD ₆₀₀ = 0,3 (рис.). Как при OD ₆₀₀ = 0,01, так и при OD ₆₀₀ = 0,3, экспрессия lecM в мутанте hrpG была значительно ниже, чем в OE1-1. Кроме того, экспрессия lecM в мутанте, удаленном phcA , была также значительно ниже, чем в OE1-1, как при OD ₆₀₀ = 0,01, так и OD ₆₀₀ = 0,3. Эти результаты показывают, что OE1-1 при OD ₆₀₀ = 0.3 экспрессирует lecM сильнее, чем при OD ₆₀₀ = 0,01, а экспрессия lecM зависит от HrpG и PhcA.

Экспрессия lecM в штамме Ralstonia solanacearum OE1-1, культивированном в апопластных жидкостях растений томатов, собранных при оптической плотности 0,01 и 0,3 при 600 нм (OD ₆₀₀ ) и использованных для экстракции РНК, как описано в экспериментальных процедурах. Ген rpoD использовали в качестве внутреннего контроля для количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).Уровни РНК анализируемых генов выражены относительно уровня экспрессии rpoD . Эксперимент проводился как минимум дважды с использованием независимых партий образцов с аналогичными результатами. Показаны результаты для единственной репрезентативной выборки. Показаны средние значения ± стандартное отклонение (SD) (планки ошибок) трех определений кДНК из одного репрезентативного образца. КОЕ, колониеобразующие единицы.

Мутация

Компоненты поверхности бактерий и внеклеточные соединения, такие как EPS, а также в первую очередь жгутики и липополисахариды имеют решающее значение для аутоагрегации и развития биопленок у большинства видов бактерий (Bogino et al. al ., 2013). Таким образом, мы количественно оценили общий основной EPS, EPS I, продуцируемый сопоставимыми числами (1,0 × 10 ⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ), ОП ₆₀₀ = 0,01) клеток R. solanacearum , растущих на ¼ × M63. планшеты с использованием иммуноферментного анализа (ELISA). Мутант lecM продуцировал значительно меньше EPS I, чем OE1-1 и lecM -comp (рис.).

Иммунологический количественный анализ экзополисахарида I (EPS I) в супернатантах с использованием иммуноферментного анализа (ELISA) с анти- R.solanacearum EPS I антитела [оптическая плотность при 650 нм (OD ₆₅₀ )]. Звездочки указывают на значительные различия в значениях OD ₆₅₀ для клеток дикого типа ( P <0,05, t -test).

Обсуждение

Мы сосредоточились на колонизации межклеточных пространств штаммом OE1-1, который необходим для его вирулентности (Hikichi et al ., 2007). Микроскопические наблюдения в этом исследовании показали агрегацию клеток R. solanacearum в межклеточных пространствах растений томата (рис. И а) и образование биопленок на поверхностях клеток томатов, прилегающих к межклеточным пространствам (рис.б). Более того, клетки OE1-1 продуцируют зрелые биопленки грибного типа при инкубации в апопластных жидкостях растений томатов (Fig. A – c). Эти результаты демонстрируют, что клетки OE1-1 прикрепляются к клеткам томатов и образуют зрелые биопленки, что приводит к колонизации межклеточных пространств. Насколько нам известно, это первое сообщение об образовании биопленок с помощью R. solanacearum на клетках растений-хозяев после инвазии в межклеточные пространства и о биопленках грибного типа, продуцируемых R. solanacearum in vitro .

Фрагмент длиной 3,8 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК OE1-1 со следующими праймерами (добавленные сайты Bam HI показаны курсивом): 5 ‘ ‐CG GGATCC ATGTCTCCGGTCTTGCCCAGG ‐ 3 ‘(Bam ‐ lecM ‐ FW) и 5’‐ CG GGATCC ATGGGACCAGGCTTCCAGGACG ‐ 3′ (Bam ‐ lecM ‐ RV).Расщепленный фрагмент Bam HI и 2,6 т.п.н. Bam HI- и Pst I-переваренный фрагмент ДНК, содержащий sacB из pUCD800 (Gay et al ., 1985), лигировали в Bam . HI и Pst, I сайтов pHSG398 (Takara) для создания pHHSG398lecM. Также использовалась система вставки, опосредованная транспозомами EZ: TN (Epicenter, Madison, WI, США). Транспозон EZ :: TN был вставлен в pHHSG398lecM в соответствии с инструкциями производителя.Транспозиционные клоны отбирали путем посева на среду PY (Kanda et al ., 2003a), содержащую канамицин и хлорамфеникол, создавая pHHSG398lecM :: EZ- Tn 5. Секвенирование ДНК фрагментов ДНК, амплифицированных ПЦР, с использованием 5′-CTTTCGGAGATTCACTCGC-3 ′ (LecM ‐ pSQFW) и 5′ ‐ AAGCAGTGGGAACCGATCAG ‐ 3 ′ (lecM ‐ pSQRV) в качестве праймеров выполняли для проверки правильности вставки EZ :: TN в lecM (данные не показаны), показывая, что транспозон был вставлен между 40-м и 41-м нуклеотидами lecM .Эту плазмиду электропорировали в клетки OE1-1, и был выбран канамицин-устойчивый, хлорамфеникол-чувствительный и устойчивый к сахарозе рекомбинант, OE1-1- lecM :: EZ- Tn 5 (мутант lecM ). Для проверки правильности замены мутировавшего lecM в ОЭ1‐1 (данные не показаны).

Фрагмент размером 1,3 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК OE1-1 со следующими праймерами: 5′-ACTACGAGGCCTACCTGTAC-3 ′ (lecM ‐ souho ‐ FW) и 5′ ‐ AGCGTGGAAAGACAAACGGC ‐ 3 ′ (lecM ‐ souho‐ Р.В.).Фрагмент ПЦР вставляли в pMD20, создавая pMD20lecM. 1,3-kbp Bam HI- и Hind III-переваренный фрагмент pMD20lecM был лигирован в сайты Bam HI и Hind III pUC18-mini- Tn 7T-Gm, создавая pUC18-mini- Tn 7T ‐ Gm ‐ lecM. Эту плазмиду электропорировали в мутант lecM с вектором экспрессии транспозазы Т7 pTNS2, и был выбран устойчивый к канамицину и гентамицину трансформант lecM -comp.Секвенирование ДНК амплифицированных ПЦР фрагментов ДНК с использованием lecM-souho-FW и lecM-souho-RV в качестве праймеров было выполнено для проверки вставки lecM в мутант lecM (данные не показаны).

Количественная ПЦР в реальном времени

Суммарная РНК была выделена из штаммов R. solanacearum при OD ₆₀₀ = 0,01 и OD ₆₀₀ = 0,3 с использованием набора High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) в соответствии с инструкциями производителя.Обратную транскрипцию проводили с 500 нг тотальной РНК с использованием набора реагентов PrimeScript RT (Takara) в соответствии с инструкциями производителя. qRT-PCR выполняли в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл исходной кДНК и 10 мкМ соответствующих праймеров, с использованием системы реагентов для qPCR SYBR GreenER (Invitrogen, Tokyo, Japan) с системой Applied Biosystems 7300 для ПЦР в реальном времени. . Параметры циклов были одинаковыми для всех праймеров: начальная 95 ° C в течение 30 с, затем 40 циклов при 95 ° C в течение 5 с и 60 ° C в течение 31 с.В конце каждой ПЦР выполняли прогоны кривой плавления для проверки специфичности праймеров по присутствию единственного продукта. Фрагменты ДНК lecM и rpoD были синтезированы с использованием 5′-TCAGCCCAGCGGCCAGTTCAG-3 ‘(лектин-FW) и 5′-AGATGGGAGTCGTCGTCGTCGTG-3′ (rpoD-RV) соответственно. Затем была проведена ПЦР с использованием 5’-GGCTCAGCAAGGTGTATTCACGC-3 ‘(лектин-ORF-FW1) и лектина-FW для амплификации фрагмента ДНК длиной 343 п.н., специфичного для lecM , и 5′-ATCGTCGAGCGCAACATCCC-3′ (rpoD ) и rpoD-RV для амплификации фрагмента ДНК длиной 331 п.н., специфичного для rpoD .Специфичность праймеров в этих условиях ПЦР сначала проверяли электрофорезом в агарозном геле, который давал единственный продукт ожидаемого размера молекулы. Мы также проверили последовательности амплифицированных фрагментов ДНК путем прямого секвенирования с прямым праймером каждого соответствующего гена. Относительная количественная оценка экспрессии генов проводилась в соответствии с инструкциями для системы ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 7300 с использованием метода сравнительного порога цикла (Ct) для расчета количественного значения.Все значения были нормализованы к значению экспрессии гена rpoD в качестве внутреннего стандарта в каждой исходной кДНК. Анализы экспрессии проводили по крайней мере с двумя биологическими повторениями, чтобы гарантировать воспроизводимость паттернов экспрессии. Характерные данные представлены на рисунках. Стандартные отклонения и различия между коэффициентами экспрессии необработанного контроля и других образцов были проверены на статистическую значимость с использованием t -test.

Наблюдение флуоресценции, происходящей от gOE1-1, в межклеточных пространствах листьев томатов под флуоресцентным фазово-контрастным микроскопом

Листья 5-недельных растений томатов ( Solanum lycopersicum cv.Ohgata-Fukuju) были инфильтрированы меченным GFP штаммом OE1-1 R. solanacearum (gOE1-1) в 50 мкл бактериальной суспензии при 1,0 × 10 ⁸ КОЕ / мл с использованием одноразового шприца объемом 1 мл ( SS ‐ 01T, Терумо, Токио, Япония). После инкубации в течение 18 часов при 25 ° C флуоресценцию, полученную от gOE1-1, наблюдали через 18 часов после инфильтрации под флуоресцентным фазово-контрастным микроскопом (FSX-100, Olympus, Токио, Япония).

Наблюдение

Листья 5-недельных растений томатов инфильтрировали штаммом OE1-1 в 50 мкл бактериальной суспензии при 1.0 × 10 ⁸ КОЕ / мл с использованием одноразового шприца емкостью 1 мл. После инкубации в течение 18 и 24 часов при 25 ° C листья томатов фиксировали 2,5% глутаральдегидом в 0,1 м фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) при комнатной температуре в течение 2 часов в условиях вакуума. После двукратной промывки листьев PBS и сушки при комнатной температуре нижние слои эпидермиса отделяли пинцетом. Листья с удаленным эпидермисом были подвергнуты вакуумному осаждению платиной с использованием устройства для нанесения ионного распыления (NeoCoater MP ‐ 19020NCTR, JEOL, Tokyo, Japan) в соответствии с инструкциями производителя.Образец на фильтре был установлен непосредственно на держателе образца и исследован с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM ‐ 6010LV (JEOL).

Наблюдение за

Ночные культуры штаммов R. solanacearum , скорректированные до OD ₆₀₀ = 0,005 (10 мкл), использовали для инокуляции 190 мкл среды на наноперколяторы фильтруют (JEOL) и инкубируют без встряхивания в течение 24 часов при 30 ° C. После удаления супернатанта 100 мкл ледяного 4% параформальдегида в PBS было добавлено к бактериям на фильтрах наноперколяторов.Фиксацию продолжали при комнатной температуре в течение 1 ч. Фиксированные бактерии дважды промывали деионизированной водой и затем сушили при комнатной температуре. Бактерии на нано-перколяторных фильтрах были осаждены в вакууме с золотом с использованием устройства для нанесения ионного напыления (Hitachi E-1010, Hitachi High-Technologies Corporation, Токио, Япония) в соответствии с инструкциями производителя. Образец на фильтре был установлен непосредственно на держателе образца и исследован с использованием SEM Miniscope® TM ‐ 3000 (Hitachi High ‐ Technologies Corporation) и JSM ‐ 6010LV SEM.

Анализы биопленок

Производство биопленок штаммами R. solanacearum было измерено in vitro с использованием незначительной модификации анализа микротитровального планшета с ПВХ (O’Toole and Kolter, 1998). Вкратце, 5 мкл ночных культур R. solanacearum , доведенных до OD ₆₀₀ = 0,005, использовали для инокуляции 95 мкл среды в лунки микротитровального планшета из ПВХ (NUNC MICRO WELL PLATE, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Массачусетс, США) и инкубировали без встряхивания в течение 24 ч при 30 ° C.Для количественной оценки развития биопленок в лунки добавляли 25 мкл 1,0% раствора кристаллического фиолетового. После 15 мин инкубации несвязавшееся кристаллическое фиолетовое пятно осторожно удалили пипеткой, а лунки промыли по очереди дистиллированной водой, 70% этанолом и дистиллированной водой. Кристаллический фиолетовый в каждой лунке солюбилизировали добавлением 100 мкл 100% этанола и количественно определяли по поглощению при 550 нм. Величину образования биопленки нормализовали по количеству клеток. Эта величина была названа относительным образованием биопленки (OD ₅₅₀ / OD ₆₀₀ ).

Прикрепляющая способность и образование микроколоний

Нитроцеллюлозные мембраны (2 × 2 см ² ), полученные из целлюлозных трубок Visking, и предметные стекла были пропитаны суспензиями штаммов R. solanacearum при 1,0 × 10 ⁸ КОЕ / мл в чашках Петри (диаметр 9 см). После инкубации в течение 24 ч при 30 ° C нитроцеллюлозные мембраны и предметные стекла наблюдали под фазово-контрастным микроскопом (FSX-100, Olympus).

Производительность EPS I

Количественный анализ продукции EPS I был проведен с использованием ELISA.Ночную культуру штаммов R. solanacearum промывали и разбавляли до плотности клеток 1,0 × 10 ³ КОЕ / мл. Аликвоту 100 мкл этой клеточной суспензии разливали на чашки с агаровой средой ¼ × M63 и инкубировали в течение 2 дней при 30 ° C. Затем клетки ресуспендировали до 1,0 × 10 ⁵ КОЕ / мл. Плотность клеток подтверждали посевом для разведения. EPS I был количественно определен с использованием антител против R. solanacearum EPS I с помощью ELISA (Agdia Inc., Элкхарт, Индиана, США) в соответствии с инструкциями производителя на объем 100 мкл (1.0 × 10 ⁴ КОЕ) суспензии клеток (было оценено три технических повтора). Продуктивность EPS I количественно определяли по поглощению при 650 нм.

Анализы вирулентности

Растения томатов выращивали в горшках, содержащих смесь вермикулита и торфяного мха (3: 1), в камере для выращивания при 25 ° C и менее 10 000 лк в течение 16 часов в день; их поливали раствором Хогланда, разбавленным в пять раз (Hikichi et al ., 1999). Восьминедельные растения томатов инокулировали бактериями двумя способами.Для инфильтрации листьев в листья томатов (Roberts et al ., 1988) 50 мкл бактериальной суспензии с концентрацией 1,0 × 10 ⁸ КОЕ / мл вводили в листья томатов с помощью одноразового шприца объемом 1 мл. Для инокуляции корней погружением (Hikichi et al ., 1999) корни томатов замачивали в бактериальной суспензии при 1,0 × 10 ⁸ КОЕ / мл в течение 30 минут, а затем промывали проточной водой. Растения, инокулированные методом окунания корней, выращивали в горшках для водных культур (Yamato Water Culture Pot No.1, Yamato Plastic Co. Ltd., Яматотакада, Япония) с пятикратным разведением раствора Хогланда. Для всех анализов концентрации посевного материала определяли спектрофотометрически и подтверждали посевом для разведения. Все инокулированные растения выращивали в помещении для выращивания при 25 ° C и менее 10 000 лк в течение 16 часов в день. В каждом испытании обрабатывали 12 растений каждого штамма, получая 60 растений на штамм. Растения кодировали и проверяли на наличие симптомов увядания ежедневно после инокуляции. Растения оценивали по шкале индекса болезни следующим образом: 0 — отсутствие увядания; Увядание 1,1–25%; 2, 26–50% увядание; 3, увядание 51–75%; 4,76–99%; 5, мертвый.Каждый анализ повторяли в пяти последовательных испытаниях.

Популяции бактерий в растениях томатов

Инфицированная бактериями область (0,5 см ² ) в листьях томата вырезали из пяти растений каждого набора ежедневно после инфильтрации. Корни вырезали через 0, 1, 2 и 3 дня после инокуляции с пяти растений каждого набора, которые были инокулированы бактериями через корни. Каждый образец растирали в 1 мл дистиллированной воды с помощью ступки и пестика. 0,1 мл образца исходной суспензии или 10-кратного серийного разведения наносили на три чашки со средой Хара-Оно (Hara and Ono, 1983).Для мутанта lecM и lecM -comp среда содержала 50 мкг / мл канамицина и 50 мкг / мл гентамицина соответственно. Колонии подсчитывали через 2 дня инкубации при 30 ° C.

Экстракция апопласта и ксилемы

Жидкость апопласта из листьев была экструдирована модифицированными методами de Wit и Spikman (1982), Shinohara et al . (2005) и Зулуага и др. . (2013). Вкратце, третий лист верхушки 5-недельного растения томата был разрезан, промыт дистиллированной водой и высушен бумажным полотенцем.Затем в шприц емкостью 1 мл вводили от одного до трех листьев с 15 мл дистиллированной воды и применяли циклы давление-вакуум до тех пор, пока листья полностью не пропитались. После инфильтрации листья осторожно вынимали из шприца и промокали бумажным полотенцем. Затем каждый лист вводили в шприц объемом 5 мл, помещенный в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую пробирку для сбора 1,5 мл. Экстракт апопласта собирали центрифугированием пробирок при 4 000 g в течение 5 мин при комнатной температуре.Фракцию, собранную в пробирке объемом 1,5 мл, снова центрифугировали в течение 5 мин при 4000 g при комнатной температуре. Супернатант фильтровали через мембранный фильтр (размер пор 0,2 мкм) (Minisart CE; Sartorius, Gottingen, Germany) и хранили при -20 ° C до использования.

Ксилемную жидкость из стеблей экструдировали модифицированными методами Shinohara et al . (2005) и Зулуага и др. . (2013). Вкратце, 5-недельные растения томатов срезали бритвенным лезвием у стеблей примерно на 10 см над землей.Срезанный стебель промывали 2 мл дистиллированной воды и сушили бумажным полотенцем для удаления содержимого срезанных клеток и первого выделившегося сока. Стебли срезали бритвенным лезвием, а затем вводили в шприц объемом 5 мл, помещенный в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую пробирку для забора крови объемом 1,5 мл. Экстракт ксилемы собирали центрифугированием пробирок при 4000 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Фракцию, собранную в пробирке объемом 1,5 мл, снова центрифугировали в течение 5 мин при 4000 g при комнатной температуре.Супернатант фильтровали через мембранный фильтр 0,2 мкм и хранили при -20 ° C до использования.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников нашей лаборатории доктора Аями Канда и г-жу Шихо Исикава за анализ биопленок. Эта работа была поддержана грантами на научные исследования Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии (№№ 24580066, 252

Список литературы

• Алдон, Д. , Брито, Б. , Буше, К. а также Генин, С. (2000) Бактериальный сенсор контакта с растительной клеткой контролирует индукцию транскрипции генов патогенности Ralstonia solanacearum . EMBO J. 19, 2304–2314. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Аллен, К. , Хуанг, Ю. а также Секейра, Л. (1991) Клонирование генов, влияющих на продукцию полигалактуроназы в Pseudomonas solanacearum . Мол. Взаимодействие растений и микробов.4, 147–154. [Google Scholar]
• Аро-Разу, И. , Вассе, Дж. , Монтрозье, Х. , Etchebar, C. а также Тригалет, А. (1998) Обнаружение и визуализация главного кислого экзополисахарида Ralstonia solanacearum и его роли в инфицировании корней томатов и колонизации сосудов. Евро. J. Plant Pathol. 104, 795–809. [Google Scholar]
• Богино, П. , Олива, М. , Сорроче, Ф. а также Джордано, В. (2013) Роль бактериальных биопленок и поверхностных компонентов в растительно-бактериальных ассоциациях.Int. J. Mol. Sci. 14, 15 838–15 859. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Бранда, С. , Вик, С. , Фридман, Л. а также Колтер, Р. (2005) Биопленки: новый взгляд на матрицу. Trends Microbiol. 13, 20–26. [PubMed] [Google Scholar]
• Брито, Б. , Маренда, М. , Барберис, П. , Буше, К. а также Генин, С. (1999) prhJ и hrp G, два новых компонента сигнально-зависимого регуляторного каскада, контролируемого PrhA в Ralstonia solanacearum .Мол. Microbiol. 31, 237–251. [PubMed] [Google Scholar]
• Брито, Б. , Алдон, Д. , Барберис, П. , Буше, К. а также Генин, С. (2002) Система передачи сигнала через три компартмента трансдуцирует контакт-зависимый сигнал растительной клетки, контролирующий гены Ralstonia solanacearum hrp . Мол. Взаимодействие растений и микробов. 15, 109–119. [PubMed] [Google Scholar]
• Брамбли, С. , Карни, Б.Ф. а также Денни, Т. (1993) Преобразование фенотипа в Pseudomonas solanacearum из-за спонтанной инактивации PhcA, предполагаемого регулятора транскрипции LysR.J. Bacteriol. 175, 5477–5487. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Чой, К. , Гейнор, Дж. Б. , Уайт, К. , Лопес, К. , Босио, К. , Каркофф-Швейцер, Р. а также Швейцер, Х. (2005) Система клонирования и экспрессии бактерий широкого диапазона на основе Tn 7. Nat. Методы, 2, 443–448. [PubMed] [Google Scholar]
• Коэн, Г. а также Рикенберг, Х. (1956) La galactoside-perméase d ’ Escherichia coli . Анна. Inst. Пастер (Париж), 91, 693–720.[PubMed] [Google Scholar]
• Конрад, Дж. (2012) Физика приповерхностной подвижности бактерий с использованием жгутиков и пилей IV типа: значение для образования биопленок. Res. Microbiol. 163, 619–629. [PubMed] [Google Scholar]
• Данхорн, Т. а также Фукуа, К. (2007) Формирование биопленки бактериями, ассоциированными с растениями. Анну. Rev. Microbiol. 61, 401–422. [PubMed] [Google Scholar]
• Дэйви, М. а также О’Тул, Г.А. (2000) Микробные биопленки: от экологии к молекулярной генетике.Microbiol. Мол. Биол. Ред. 64, 847–867. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Диггл, С. , Стейси, Р. , Додд, К. , Камара, М. , Уильямс, П. а также Винзер, К. (2006) Галактофильный лектин, LecA, способствует развитию биопленок у Pseudomonas aeruginosa . Environ. Microbiol. 8, 1095–1104. [PubMed] [Google Scholar]
• Флавье, А. , Клаф, С.Дж. , Шелл, М.А. а также Денни, Т. (1997) Идентификация метилового эфира 3-гидроксипальмитиновой кислоты как нового ауторегулятора, контролирующего вирулентность в Ralstonia solanacearum .Мол. Microbiol. 26, 251–259. [PubMed] [Google Scholar]
• Флемминг, Х. а также Вингендер, Дж. (2010) Матрица биопленки. Nat. Rev. Microbiol. 8, 623–633. [PubMed] [Google Scholar]
• Гей, П. , Ле Кок, Д. , Штейнмец, М. , Беркельман, Т. а также Кадо, К. (1985) Процедура положительного отбора для включения элементов инсерционной последовательности в грамотрицательные бактерии. J. Bacteriol. 164, 918–921. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Генин, С. а также Денни, Т.П. (2012) Патогеномика комплекса видов Ralstonia solanacearum . Анну. Rev. Phytopathol. 50, 67–89. [PubMed] [Google Scholar]
• Генин, С. , Брито, Б. , Денни, Т. а также Буше, К. (2005) Контроль генов системы секреции типа III (Hrp) Ralstonia solanacearum с помощью глобального регулятора вирулентности PhcA. FEBS Lett. 579, 2077–2081. [PubMed] [Google Scholar]
• Гильбоа-Гарбер, Н. (1986) Лектины Pseudomonas aeruginosa : свойства, биологические эффекты и применение В: Микробные лектины и агглютинины: свойства и биологическая активность (Мирельман Д., ред.), с. 255–269. Нью-Йорк: Джон Уайли и сыновья. [Google Scholar]
• Гильбоа-Гарбер, Н. (1996) К адгезионной терапии против Pseudomonas aeruginosa . Adv. Exp. Med. Биол. 408, 39–50. [PubMed] [Google Scholar]
• Гильбоа-Гарбер, Н. а также Гарбер, Н. (1989) Совместное действие микробных лектинов с литической активностью как модель общей основной роли лектина. FEMS Microbiol. Ред. 5, 211–321. [PubMed] [Google Scholar]
• Холл-Стодли, Л. . а также Стоодли, П.(2009) Развивающиеся концепции инфекций биопленок. Cell Microbiol. 11, 1034–1043. [PubMed] [Google Scholar]
• Ханахан, Д. (1983) Исследования трансформации Escherichia coli плазмидами. J. Mol. Биол. 166, 557–580. [PubMed] [Google Scholar]
• Хара, Х. а также Оно, К. (1983) Экологические исследования бактериального увядания табака, вызываемого Pseudomonas solanacearum E. F. Smith. I. Селективная среда для выделения и обнаружения P .solanacearum. Бык. Окаяма Тоб. Exp. Стн. 42, 127–138. [Google Scholar]
• Хейворд, Х. (1991) Биология и эпидемиология бактериального увядания, вызываемого Pseudomonas solanacearum . Анну. Rev. Phytopathol. 29, 65–87. [PubMed] [Google Scholar]
• Хикичи, Ю. , Накадзава-Насу, Ю. , Китаносоно, С. , Судзуки, К. а также Окуно, Т. (1999) Поведение генетически люкс -маркированного Ralstonia solanacearum в привитых сортах томатов, устойчивых или чувствительных к бактериальному увяданию.Анна. Фитопатол. Soc. Jpn. 65, 597–603. [Google Scholar]
• Хикичи, Ю. , Йошимочи, Т. , Цудзимото, С. , Шинохара, Р. , Накахо, К. , Канда, А. , Киба, А. а также Охниши, К. (2007) Глобальная регуляция механизма патогенности Ralstonia solanacearum . Plant Biotechnol. 24, 149–154. [Google Scholar]
• Хуанг, Дж. , Карни, Б.Ф. , Денни, Т. , Вайсингер, А. а также Шелл, М.А. (1995) Сложная сеть регулирует экспрессию eps и других генов вирулентности Pseudomonas solanacearum . .J. Bacteriol. 177, 1259–1267. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Канда, А. , Охниши, С. , Томияма, Х. , Хасегава, Х. , Ясукочи, М. , Киба, А. , Охниши, К. , Окуно, Т. а также Хикичи, Ю. (2003a) Мутанты Ralstonia solanacearum с дефицитом механизма секреции типа III теряют способность колонизировать, что приводит к потере патогенности. J. Gen. Plant Pathol. 69, 250–257. [Google Scholar]
• Канда, А. , Ясукочи, М. , Охниши, К., Киба, А. , Окуно, Т. а также Хикичи, Ю. (2003b) Эктопическая экспрессия эффекторного белка Ralstonia solanacearum PopA на ранней стадии инвазии приводит к потере вирулентности. Мол. Взаимодействие растений и микробов. 16, 447–455. [PubMed] [Google Scholar]
• Канда, А. , Цунейши, К. , Мори, А. , Охниши, К. , Киба, А. а также Хикичи, Ю. (2008) Аминокислотная замена в положении 740 в σ70 штамма OE1-1 Ralstonia solanacearum влияет на его рост in planta .Прил. Environ. Microbiol. 74, 5841–5844. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Канда, А. , Охниши, К. , Киба, А. а также Хикичи, Ю. (2009) Влияние С-концевой мутации PopA штамма Ralstonia solanacearum OE1-1 на развитие бактериального увядания. Завод Патол. 58, 159–169. [Google Scholar]
• Канг, Ю. , Лю, Х. , Генин, С. , Шелл, М.А. а также Денни, Т. (2002) Ralstonia solanacearum требует, чтобы пили типа 4 прилипали к нескольким поверхностям, а также для естественного преобразования и вирулентности.Мол. Microbiol. 46, 427–437. [PubMed] [Google Scholar]
• Киба, А. , Галис, И. , Ходжо, Ю. , Охниши, К. , Йошиока, Х. а также Хикичи, Ю. (2014) Белок-переносчик фосфолипидов SEC14 участвует в иммунных ответах растений, опосредованных передачей липидов, у Nicotiana benthamiana . PLoS One, 9, e98150. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Киба, А. , Накано, М. , Винсент-Поуп, П. , Такахаши, Х. , Савасаки, Т. , Эндо, Ю. , Охниши, К. , Йошиока, Х.а также Хикичи, Ю. (2012) Новый белок-переносчик фосфолипидов Sec14 из Nicotiana benthamiana активируется в ответ на инфекцию Ralstonia solanacearum , патоген-ассоциированные молекулярные структуры и эффекторные молекулы и участвует в иммунитете растений. J. Plant Physiol. 169, 1017–1022. [PubMed] [Google Scholar]
• Клаузен, М. , Ааес ‐ Йогенен, А. , Молин, С. а также Толкер-Нильсен, Т. (2003) Участие миграции бактерий в развитии сложных многоклеточных структур в биопленках Pseudomonas aeruginosa .Мол. Microbiol. 50, 61–68. [PubMed] [Google Scholar]
• Лю, Ю. , Канда, А. , Киба, А. , Хикичи, Ю. , Айно, М. , Кавагути, А. , Мидзогучи, С. , Накахо, К. , Шиоми, Х. , Такикава, Ю. а также Охниши, К. (2009) Молекулярное типирование японских штаммов Ralstonia solanacearum и связь со способностью вызывать гиперчувствительную реакцию у табака. Дж . Gen. Plant Pathol. 75, 369–380. [Google Scholar]
• Мэнсфилд, Дж., Генин, С. , Магори, С. , Цитовский, В. , Шриариян, М. , Рональд, П. , Доу, М. , Вердье, В. , Пиво, С. ; Мачадо, М.А. , Тот, И. , Салмонд, Г. а также Фостер, Г. (2012) Топ-10 патогенных бактерий растений в молекулярной патологии растений. Мол. Завод Патол. 13, 614–629. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Мэн, Ф. , Бабуджи, Л. , Джейкобс, Дж. а также Аллен, К. (2015) Сравнительный анализ транскриптома выявляет холодные факторы вирулентности Ralstonia solanacearum race 3 биовара 2.PLOS ONE 10, e0139090. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Мэн, Ф. , Яо, Дж. а также Аллен, К. (2011) Мутант MotN Ralstonia solanacearum является гипермобильным и обладает пониженной вирулентностью. J. Bacteriol. 193, 2477–2486. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Мондс, Р. а также О’Тул, Г.А. (2009) Модель развития микробных биопленок: десять лет парадигмы для обзора. Trends Microbiol. 17, 73–87. [PubMed] [Google Scholar]
• Моррис, К.Э. а также Монье, Дж. (2003) Экологическое значение образования биопленок бактериями, ассоциированными с растениями. Анну. Rev. Phytopathol. 41, 429–453. [PubMed] [Google Scholar]
• Накано, М. , Нишихара, М. , Йошиока, Х. , Такахаши, Х. , Савасаки, Т. , Охниши, К. , Хикичи, Ю. а также Киба, А. (2013) Подавление фосфатазы фосфатидной кислоты DS1 подтверждает устойчивость к Ralstonia solanacearum в Nicotiana benthamiana . PLoS One, 8, e75124. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• О’Тул, Дж.А . а также Колтер, Р. (1998) Жгутиковые и судорожные движения необходимы для развития биопленки Pseudomonas aeruginosa. Мол. Microbiol. 30, 295–304. [PubMed] [Google Scholar]
• Парсек, М. а также Фукуа, К. (2004) Biofilms 2003: новые темы и проблемы в исследованиях микробной жизни, связанной с поверхностью. J. Bacteriol. 186, 4427–4440. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Петрова, О. а также Зауэр, К. (2012) Сложные ситуации: ключевые компоненты, контролирующие прикрепление бактерий к поверхности.J. Bacteriol. 194, 2413–2425. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Рэми, Б. , Кутсудис, М. , фон Бодман, С. а также Фукуа, К. (2004) Формирование биопленок в растительно-микробных ассоциациях. Curr. Opin. Microbiol. 7, 602–609. [PubMed] [Google Scholar]
• Ринауди, Л. а также Джордано, В. (2010) Комплексный взгляд на образование биопленок у ризобий. FEMS Microbiol. Lett. 304, 1–11. [PubMed] [Google Scholar]
• Робертс, П. , Денни, Т. а также Шелл, М.А. (1988) Клонирование гена egl из Pseudomonas solanacearum и анализ его роли в фитопатогенности. J. Bacteriol. 170, 1445–1451. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сэмбрук, Дж. , Фрич, Э.Ф. а также Маниатис, Т. (1989) Молекулярное клонирование: лабораторное руководство, 2-е изд. Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор. [Google Scholar]
• Шелл, М.А. (2000) Контроль генов вирулентности и патогенности Ralstonia solanacearum с помощью сложной сенсорной сети.Анну. Rev. Phytopathol. 38, 263–292. [PubMed] [Google Scholar]
• Шинохара, Р. , Канда, А. , Охниши, К. , Киба, А. а также Хикичи, Ю. (2005) Вклад биосинтеза фолиевой кислоты в пролиферацию Ralstonia solanacearum в межклеточных пространствах. Прил. Environ. Microbiol. 71, 417–422. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Шриханта, Ю. , Dowideit, S.J. , Эдвардс, Дж. , Фальсетта, М. , Ву, Х.Дж. , Харрисон, О. , Фокс, К. , Сейб, К.Л. , Магуайр, Т. , Ван, А. , Дева, M.C. , Гриммонд, С. , Апичелла, М.А. а также Дженнингс, М. (2009) Фазварионы опосредуют случайное переключение экспрессии генов у патогенных Neisseria. PLoS Pathog. 5, E1000400. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Судакевиц, Д. , Имберти, А. а также Гильбоа-Гарбер, Н. (2002) Производство, свойства и специфичность нового бактериального лектина, связывающего L-фукозу и D-арабинозу, агрессивного патогена растений Ralstonia solanacearum и его сравнение с родственными растительными и микробными лектинами.J. Biochem. 132, 353–358. [PubMed] [Google Scholar]
• Судакевиц, Д. , Костланова, Н. , Блатман ‐ Ян, Г. , Митчелл, Э. , Леррер, Б. , Виммерова, М. , Каткофф, Д.Дж. , Имберти, А. а также Гильбоа-Гарбер, Н. (2004) Новый Ralstonia solanacearum высокоаффинный маннозо-связывающий лектин RS-IIL, структурно напоминающий фукозоспецифический лектин PA-IIL Pseudomonas aeruginosa . Мол. Microbiol. 52, 691–700. [PubMed] [Google Scholar]
• Тилкер, Д., Хакер, С. , Лорис, Р. , Стратманн, М. , Вингендер, Дж. , Вильгельм, С. , Розенау, Ф. а также Jaeger, K.E. (2005) Pseudomonas aeruginosa лектин LecB расположен на внешней мембране и участвует в образовании биопленок. Микробиология, 151, 1313–1323. [PubMed] [Google Scholar]
• Вальс, М. , Генин, С. а также Буше, К. (2006) Интегрированная регуляция системы секреции типа III и других детерминант вирулентности у Ralstonia solanacearum . PLoS Pathog.2, е82. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ван Гийсегем, Ф. , Гоф, К. , Зищек, К. , Никё, Э. , Арлат, М. , Генин, С. , Барберис, П. , Герман, С. , Кастелло, П. а также Буше, К. (1995) Кластер генов hrp из Pseudomonas solanacearum , который контролирует выработку системы секреции типа III, кодирует восемь белков, связанных с компонентами бактериального комплекса биогенеза жгутиков бактерий. Мол. Microbiol. 15, 1095–1114. [PubMed] [Google Scholar]
• Вассе, Дж., Фрей, П. а также Тригалет, А. (1995) Микроскопические исследования межклеточной инфекции и инвазии протоксилемы корней томатов с помощью Pseudomonas solanacearum . Мол. Взаимодействие растений и микробов. 8, 241–251. [Google Scholar]
• Уэбб, Дж. , Гивсков, М. а также Кьеллебег, С. (2003) Бактериальные биопленки: прокариотические приключения в многоклеточности. Curr. Opin. Microbiol. 6, 578–585. [PubMed] [Google Scholar]
• Винзер, К. , Фальконер, К. , Гарбер, Северная Каролина , Диггл, С.П. , Камара, М. а также Уильямс, П. (2000) Pseudomonas aeruginosa лектинов PA-IL и PA-IIL контролируются кворумом и RpoS. J. Bacteriol. 182, 6401–6411. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• де Вит, П.Дж.Г. а также Спикман, Г. (1982) Доказательства появления в межклеточной жидкости возбудителей некроза, специфичных для рас и сортов, совместимых взаимодействий между Cladosoprium fulvum и томатом. Physiol. Завод Патол. 21, 1–11.[Google Scholar]
• Ябуучи, Э. , Косако, Ю. , Яно, И. , Хотта, Х. а также Нисиучи, Ю. (1995) Перенос двух видов Burkholderia и Alcaligenes в Ralstonia gen .: предложение Ralstonia pickettii (Ralston, Palleroni and Doudoroff, 1973). nov., Ralstonia solanacearum (Smith 1896) гребн. ноя и Ralstonia eutropha (Davis, 1969) comb. ноя Microbiol. Иммунол. 39, 897–904. [PubMed] [Google Scholar]
• Ян, В.С. , Линь, Ю.М. , Ченг, Ю.С. а также Ченг, К. (2013) Ralstonia solanacearum RSc0411 ( lptC ) является детерминантом полной вирулентности и выполняет специфичную для штамма новую функцию в активности T3SS. Микробиология 159, 1136–1148. [PubMed] [Google Scholar]
• Яо, Дж. а также Аллен, К. (2006) Хемотаксис необходим для вирулентности и конкурентоспособности возбудителя бактериального увядания Ralstonia solanacearum . J. Bacteriol. 188, 3697–3708. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Йошимочи, Т., Хикичи, Ю. , Киба, А. а также Охниши, К. (2009) Глобальный регулятор вирулентности PhcA отрицательно контролирует регуляторный каскад Ralstonia solanacearum hrp , подавляя экспрессию сигнальных белков PrhIR. J. Bacteriol. 191, 3424–3428. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Чжан, Л. , Сюй, Дж. , Сюй, Дж. , Чжан, Х. , Он, Л. а также Фэн, Дж. (2014) TssB важен для вирулентности и необходим для системы секреции типа VI у Ralstonia solanacearum . .Microb. Патог. 74, 1–7. [PubMed] [Google Scholar]
• Сулуага, А. , Пуигверт, М. а также Вальс, М. (2013) Новые поступления растений, влияющие на Ralstonia solanacearum во время заражения. Передний. Microbiol. 4, 349. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Frontiers | Быстрая количественная оценка биопленок S. aureus на поверхности сосудистого трансплантата in vitro

Введение

Хотя бактериальные биопленки естественным образом встречаются в зубном налете (Sanz et al., 2017), их присутствие в основном связано с критическими заболеваниями, такими как инфекции верхних дыхательных путей или урогенитального тракта, перитонит и имплантированные медицинские устройства, которые все чаще используются (Lynch and Robertson, 2008; Romling et al., 2014) .

Сосудистые трансплантаты используются при реконструкции аорты, а из-за отсутствия материала аутологичных вен также при операциях периферического шунтирования. Несмотря на самые строгие гигиенические меры предосторожности во время операции, инфекции сосудистого трансплантата (VGI) встречаются в 2–4% случаев и связаны с высокими показателями заболеваемости и смертности (10–75%) (Hepp, 2009; Young et al., 2012). Грамположительные микроорганизмы, такие как Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis , обычно являются причиной инфекций трансплантата аорты (Chaufour et al., 2017).

Бактериальная колонизация поверхности сосудистого трансплантата связана с производством бактериальной биопленки, накоплением внеклеточного полимерного матрикса (EPS), состоящего из полисахаридов, белков, гликолипидов и бактериальной ДНК (Becker et al., 2014). EPS защищает бактерии, предотвращая проникновение макромолекул, таких как антибиотики и воспалительные клетки иммунной защиты, в матрицу биопленки, а также отображая диффузионный барьер для молекул с антимикробными свойствами (Olsen, 2015).Внутри биопленки субпопуляции могут становиться метаболически неактивными и образовывать спящие клетки-персистеры. Поскольку некоторые антибиотики эффективны только в отношении метаболически активных бактерий, покоящиеся бактерии могут быть нечувствительны к антибиотикам (Lewis, 2007).

Наряду со стандартизованными предоперационными и периоперационными мерами профилактики против ИГИ (предварительный скрининг на множественную лекарственную устойчивость, контроль параметров инфекции, антимикробная профилактика), также может быть региональное высвобождение антибиотиков из сосудистых трансплантатов (предварительное замачивание трансплантата антибиотиками). играют эффективную роль (Килинг и др., 2009; Куен и др., 2010; Bisdas et al., 2012).

Растущая устойчивость и толерантность бактериальных биопленок к антибиотикам требует использования альтернативных противомикробных веществ. Альтернативой терапии биопленок S. aureus на сосудистых трансплантатах могут быть, например, эндолизины бактериофагов, такие как HY-133, со специфической эффективностью против S. aureus (Idelevich et al., 2011, 2016; Herten et al. , 2017). Чтобы оценить противомикробную эффективность таких альтернативных противомикробных веществ, необходимо количественное определение бактериальных биопленок.

Для обнаружения бактериальных биопленок доступно несколько методов, основанных на (а) накоплении красителя / пигментов, связывающихся с отрицательными зарядами, присутствующими в EPS, например кристаллический фиолетовый (O’toole et al., 2000; Stepanovic et al. ., 2000) или сафранин (Patterson et al., 2010), или (b) ДНК-связывающие красители (DAPI, Hoechst, SYTO9 или акридиновый оранжевый, Palestrant et al., 2004; Peeters et al., 2008) или КПЦР, или (c) метод культивирования [расчет колониеобразующих единиц (КОЕ) (Alt et al., 2004)], время повторного роста до определенной мутности] или (d) определение метаболической активности [АТФ (Gracia et al., 1999; Kapoor and Yadav, 2010), соль тетразолия МТТ, резазурин (аламарский синий) (Hatzinger et al., 2003; Pettit et al., 2009)] или целостность мембраны (например, окрашивание живого / мертвого SYTO9 / пропидия йодид, Tawakoli et al. ., 2013).

Однако количественная оценка бактериальных биопленок в основном проводилась на поверхности полистирола, для других поверхностей доступно лишь несколько методов (Pitts et al., 2003). Для количественной оценки биопленок на постоянных устройствах подсчет КОЕ, по-видимому, до сих пор был стандартным методом и заменил предыдущее радиоактивное мечение бактерий (Schmitt et al., 1986).

Целью настоящего исследования была проверка модели in vitro для быстрой количественной оценки прилипания бактериальной биопленки к материалу сосудистого трансплантата с помощью анализа АТФ по сравнению с подсчетом КОЕ и анализом кристаллического фиолетового (Cry).

Методы

Ночное культивирование бактерий

Для экспериментов использовали два клинических изолята S. aureus (BEB-029 и BEB-295), продуцирующих биопленку, а также лабораторный штамм Sh2000. Видовая принадлежность подтверждена обнаружением S.aureus -специфический ген nuc и устойчивость к метициллину определяли путем обнаружения гена mecA , как описано в другом месте (Becker et al., 2006). Изоляты инкубировали в течение ночи в триптическом соевом бульоне (TSB) при 36 ° C.

Экспериментальная установка

Материал сосудистого трансплантата (дакрон (полиэстер), трикотажный, (Uni-Graft ^® K DV, B. Braun, Melsungen, Германия и PTFE MAXIFLO ™ Ultrathin, Vascutek, Terumo, Франкфурт, Германия) иссекали с помощью биопсийных точек (ø 5 мм, pmf medical AG, Кельн, Германия), чтобы получить стандартизированную площадь поверхности 0.25 см. ² (фиг. 1). Диски помещали в 96-луночные планшеты из полистирола (PS) для культивирования и погружали с помощью крышек (анализ MBEC, Сент-Эдмонтон, Канада). Поверхностью контроля служил полистирол без дисков привитого материала. Все 96 лунок (с дисками и без них) инокулировали 10 ^-3 , разведенной ночной культурой в TSB с 0,25% глюкозой. Дополнительно выполняли контроль стерильности. После 4 и 18 ч инкубации при 36 ° C планктонные бактерии дважды смывали фосфатно-солевым буфером (PBS).Концентрацию биопленки измеряли на диске трансплантата и в контрольных лунках. Эксперименты проводились трижды.

Рисунок 1 . Схема эксперимента: (A) Материал сосудистого трансплантата препарировали с помощью биопсийных игл, в результате чего стандартизированная площадь поверхности составляла 0,25 см. ² и (B) , помещенные в 96-луночные планшеты для культивирования клеток из полистирола (PS).

SEM-документация бактериальных биопленок

Ночные культуры разбавляли 10 ^-3 и засевали сосудистые трансплантаты (дакрон, ПТФЭ), как описано выше.После 18-часового культивирования диски дважды промывали PBS и бактериальную биопленку фиксировали 2,5% глутардиальдегидом в PBS в течение 24 часов при 8 ° C. Постфиксацию проводили 1% тетроксидом осмия в PBS в течение 20 мин при комнатной температуре. После обезвоживания через восходящую серию этанола, заканчивающуюся 100% этанолом, образцы сушили путем сушки критической точки (Emitech, Ashford, UK / CPD 030, Bal-Tec AG, Balzers, Лихтенштейн) в соответствии с инструкциями производителя. После этого на диски напыляли золотом (E5100, Polaron Instruments, UK / SC0005 Bal-Tec AG, Бальцерс, Лихтенштейн) и анализировали с помощью последовательного электронного микроскопа (S800, Hitachi, Дюссельдорф, Германия).

Количественное определение биопленки

Все тесты были выполнены в четырех повторностях для каждого изолята (3 штамма), времени культивирования (4 и 18 ч), поверхности культивирования (дакрон, ПТФЭ и контроль PS) и типа анализа.

Анализ АТФ

Концентрацию митохондриального аденозинтрифосфата (АТФ) измеряли с помощью анализа жизнеспособности микробных клеток BacTiter-Glo ™ (Promega, Мангейм, Германия), как описано ранее (Ickert et al., 2015; Herten et al., 2017). Количество жизнеспособных бактерий определяется количеством АТФ в них и прямо пропорционально концентрации АТФ.Анализ основан на реакции люциферазы, которая катализирует реакцию люциферина и АТФ на оксилюциферин путем испускания люминесцентного сигнала, который измеряется с помощью считывающего устройства для планшетов с несколькими метками (FLX800, Biotek, Bad Friedrichshall, Германия). Предыдущие эксперименты были выполнены с различными количествами раствора для лизиса, чтобы определить концентрацию, необходимую для лизиса клеток S. aureus . Оптимальное соотношение PBS и лизирующего раствора составляло 1: 3. Вкратце, после промывания в каждую лунку добавляли 50 мкл PBS и 150 мкл раствора BacTiter-Glo ™.После 5-минутного инкубационного периода при комнатной температуре люминесцентный сигнал регистрировали в отсчетах в секунду. Кроме того, были выполнены стандартные измерения с определенным количеством S. aureus и построены стандартные кривые АТФ с определенными концентрациями АТФ (0,1–50 мкМ) для каждого измерения. Практическое время для анализа АТФ составляло 0:30 мин, результаты были доступны через 0:40 мин.

Анализ кристаллического фиолетового

Сто микролитров 1% раствора кристаллического фиолетового добавляли в каждую лунку микротитрационного планшета, содержащего диски для трансплантатов, и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин.Затем диски для трансплантатов переносили в лунки другого микротитрационного планшета, чтобы дважды промыть избыточное количество кристаллического фиолетового 200 мкл PBS. После аспирации PBS и сушки в течение ночи добавляли 50 мкл абсолютного этанола, затем встряхивали планшет и инкубировали в течение 10 минут. После удаления дисков трансплантата оптическую плотность измеряли при 570 нм с помощью спектрофотометра. Практическое время для анализа Cry составляло 1:10 ч, время инкубации 12 ч, результаты были доступны через 13:10 ч.

КОЕ Количество

Число КОЕ жизнеспособных бактерий измеряли путем нанесения серийных разведений на твердую среду. Для этого сосудистые трансплантаты промывали 100 мкл PBS и обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут, чтобы отделить и разрушить биопленку от трансплантата в среду для восстановления. После удаления дисков для трансплантата последовательные разведения содержимого лунок высевали на триптический соевый агар (TSA) в трех экземплярах. После инкубации в течение 18 ± 2 ч при 36 ° C подсчитывали количество колоний.Практическое время для анализа КОЕ составляло 2:30 ч, время инкубации 12 ч, результаты были доступны через ~ 14:30 ч.

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с помощью программного обеспечения IBM SPSS Statistics для Windows (выпуск 24, Чикаго, Иллинойс; США). Категориальные переменные выражены как частота и процент, тогда как непрерывные переменные представлены как среднее ± SD . Перед статистическим тестированием тест Колмогорова-Смирнова использовался для анализа каждой непрерывной переменной на предмет ее нормального распределения.Поскольку образцы не были распределены нормально, были использованы непараметрические тесты. Тест Манна-Уитни U использовался для сравнения непараметрических переменных двух независимых исследовательских групп. Коэффициент корреляции Пирсона (r) использовался для оценки взаимосвязи между двумя непрерывными переменными: АТФ против КОЕ на поверхности полистирола, на дакроне и на ПТФЭ, и в то время как КОЕ против Cry можно было определить только на поверхности полистирола из-за высокого фона окрашивания Плачь по сосудистому материалу.Модель линейной регрессии использовалась для оценки взаимосвязи между зависимой переменной ATP и независимой переменной CFU или Cry. Коэффициент детерминации ( R ² ) был рассчитан как статистическая мера того, насколько хорошо линия регрессии приближается к реальным точкам данных. Различия считались достоверными при p <0,05. Точность измерения анализа АТФ рассчитывалась как коэффициент вариабельности (CV) путем оценки дисперсии между и внутри анализов.

Результаты

SEM-документация бактериальных биопленок

SEM бактериальных биопленок показала отчетливо узнаваемую биопленку на отдельных нитях вязанной поверхности дакрона (рисунки 2A – C). Напротив, гораздо более гладкая поверхность ПТФЭ показала скопившиеся группы бактерий, которые были более разбросаны (Рисунки 2D – F).

Рисунок 2 . СЭМ-анализ материала сосудистого трансплантата: верхний ряд: на волокне дакрона, нижний ряд: на поверхности ПТФЭ: (A) вязаная структура; (B) волокон; (В) С.aureus биопленка штамма Sh2000 на дакроновом волокне. (D , E) Поверхность из ПТФЭ с разным увеличением; (F) S. aureus штамм Sh2000 на ПТФЭ.

Количественное определение биопленки

Все три метода анализа могут определять количество биопленок на контрольной поверхности PS (рис. 3). Воспроизводимость анализа АТФ показала дисперсию между анализами 2,1 и дисперсию внутри анализа 8,1 на полистироле. Характер роста биопленки показал увеличение бактериальной биомассы с 4 до 18 часов инкубации во всех трех методах анализа.

Рисунок 3 . Количественное определение биопленки на контрольной поверхности из полистирола. (A) Концентрация митохондриального АТФ, (B) количество КОЕ, (C) Окрашивание кристаллическим фиолетовым.

Измерение Cry с помощью спектрофотометрии не подходило для поверхностей сосудистых трансплантатов из-за сильного неспецифического фонового окрашивания.

Что касается характера роста бактерий на различных материалах трансплантата, S. aureus штаммы BEB-029 и BEB-295 показали свои самые высокие концентрации АТФ и количество КОЕ, соответственно, на контроле PS, затем на дакроне и наименьшем на PTFE ( Рисунок 4).Это соответствует интенсивности роста, отображаемой на изображениях SEM. Для штамма S. aureus Sh2000 самая высокая концентрация АТФ была продемонстрирована на материале дакрон, за которым следовали PS и PTFE, в то время как в анализе КОЕ штамм Sh2000 показал самые высокие значения на PS (нижний ряд рисунка 4).

Рисунок 4 . Количественное определение штаммов S. aureus на различных поверхностях: полистирол, дакрон и ПТФЭ. Верхний : Концентрация АТФ. Нижний : подсчет КОЕ. Данные для поверхности полистирола дополнительно изображены на Рисунке 3.

Коэффициент корреляции Пирсона показал сильный коэффициент корреляции между АТФ и КОЕ на дакроне через 4 часа для BEB-029 (0,606, p = 0,013) и умеренно высокий для BEB-295 (0,442, p = 0,086) ( Таблица 1, Таблица S1). На PS очень сильная корреляция была обнаружена для BEB-029 (0,858, p <0,001) через 4 часа и умеренно сильная для Sh2000 (0.548, p = 0,065) через 18 ч. Аналогичным образом, сильная корреляция на поверхности PS может быть обнаружена между АТФ и Cry для BEB-295 через 4 часа (0,633, p = 0,027), умеренно сильная для BEB-029 (0,408, p = 0,188) и от сильной до очень сильной корреляции через 18 часов для всех трех штаммов ( r ≥ 0,741, p <0,026).

Таблица 1 . Коэффициент корреляции Пирсона штаммов S. aureus на различных материалах (дакрон или полистирол) для АТФ vs.КОЕ, АТФ против Cry и КОЕ против Cry.

Напротив, были только отрицательные корреляции между анализами АТФ и КОЕ для поверхности ПТФЭ (диапазон r = от -0,224 до -0,811). Время до получения результата составляло 0:40 ч для АТФ, 13:10 ч для Cry и 14:30 ч для анализов CFU.

При сравнении подсчета КОЕ с анализом Cry, сильный коэффициент присутствовал только через 4 часа для BEB-029 (0,628, p = 0,029).

Обсуждение

В этом исследовании оценивалась модель in vitro для быстрой количественной оценки прилипания бактериальной биопленки к материалу сосудистого трансплантата с помощью анализа АТФ.В частности, анализ АТФ сравнивали с подсчетом КОЕ, как методом золотого стандарта, и с окрашиванием кристаллическим фиолетовым. Используя BEB-029, анализ АТФ значительно коррелировал с методом КОЕ через 4 часа, где он был полезен в качестве быстрого анализа для количественной оценки биопленки. Однако корреляция с анализом КОЕ обычно зависела от деформации и поверхности (Таблица 1, Таблица S1). Кроме того, корреляция между КОЕ и анализами АТФ в целом была лучше для незрелой биопленки (4 часа), чем для зрелой биопленки (18 часов).

Сравнение анализа АТФ и Cry на контрольной поверхности PS выявило корреляции для обоих типов биопленок: через 4 часа сильная корреляция для BEB-295, умеренно сильная корреляция для BEB-029 и через 18 часов очень сильная корреляция для BEB-029 и сильная корреляция. один для двух других штаммов.

Что касается единственной умеренно сильной корреляции между анализом АТФ и количеством КОЕ на зрелых биопленках на ФС, можно отметить, что обе системы анализа АТФ и Cry показали сопоставимые корреляции даже для зрелых биопленок, и обе не коррелировали с методом КОЕ в зрелых биопленках. биопленка.Оба анализа не требуют отделения и отделения бактериальной биопленки, что может быть причиной отсутствия корреляции с КОЕ в зрелой биопленке. Количественная оценка биопленки показала, что колонизация использованных материалов (ПТФЭ по сравнению с дакроном) различалась во времени для трех штаммов S. aureus , продуцирующих биопленку. На ПТФЭ бактериальная колонизация была ниже, как определено анализом АТФ и подсчетом КОЕ. Эти количественные результаты могут быть подтверждены качественной визуализацией с помощью SEM.

В этом исследовании мы использовали статическую модель биопленки, которая дает полезные сведения о полезности различных анализов для количественной оценки биопленок. Динамические модели биопленки могут предоставить более дифференцированную информацию и должны быть включены в дальнейшие исследования сосудистых трансплантатов, подвергшихся воздействию непрерывного кровотока.

Анализ АТФ на поверхности полистирола (ПС)

Анализ АТФ ранее использовался для обнаружения бактериальных биопленок на поверхности полистирола (PS). Gracia et al.может показать, что для бактериальной экстракции АТФ из in vitro разработал биопленок S. aureus на покрытой поверхности PS с высокой бактериальной плотностью, ДМСО оказался предпочтительным по сравнению с коммерчески доступным реагентом для лизиса бактерий (верхние пределы обнаружения 2,3 × 10 ⁹ и 2 × 10 ⁸ КОЕ / мл соответственно) (Gracia et al., 1999).

Kapoor et al. использовали анализ биолюминесценции АТФ для тестирования биоцидной чувствительности быстрорастущих микобактерий и сравнили его с обычным методом посева на агар.Они продемонстрировали, что анализ АТФ был быстрым (1,5 часа) и показал высокую чувствительность и специфичность. Используя этот метод, анализ АТФ выявил линейную зависимость между внутриклеточным АТФ и количеством клеток (КОЕ / мл) в диапазоне КОЕ 10 ³ -10 ⁷ КОЕ / мл. (Капур, Ядав, 2010). В настоящем исследовании предел обнаружения для анализа АТФ для S. aureus находился в диапазоне от 1,5 × 10 ² до более чем 10 ⁸ клеток, как описано в инструкции по применению, что, таким образом, сравнимо с пределы обнаружения, описанные Gracia и Kapoor (Gracia et al., 1999; Капур и Ядав, 2010).

Villain-Guillot et al. обнаружено S. epidermidis биопленок в 96-луночных полистирольных микротитровальных планшетах. Они представили очень хорошие корреляционные кривые ( r = 1,0) между значениями люминесценции при подсчете АТФ и количеством встроенной в биопленку S. epidermidis , определенным серийным разведением и культивированием (анализ КОЕ) (Villain-Guillot et al., 2007). Но в отличие от нашего метода каждую биопленку обрабатывали ультразвуком, бактериальную суспензию серийно разбавляли и часть ее использовали для анализа АТФ и для классического подсчета на чашках.Следовательно, в обоих анализах использовались те же разбавленные образцы бактерий, что и в исходном материале, без какой-либо ошибки, связанной с отслоением. В настоящем исследовании анализ АТФ использовался в качестве быстрого анализа, исключая этапы отделения и разведения. На поверхности PS корреляция между анализом АТФ и количеством КОЕ была очень сильной через 4 часа и умеренно сильной через 18 часов.

Анализ АТФ на постоянных медицинских устройствах / биоматериалах

Помимо полистирола, анализ АТФ также применялся для обнаружения бактериальных биопленок на постоянных медицинских устройствах / биоматериалах.Gracia et al. исследовали потенциал прилипания различных штаммов, продуцирующих биопленку, и штаммов, не продуцирующих биопленку, из штаммов S. aureus на биоматериалах, используемых в ортопедической хирургии (полиметилметакрилат, свежая кость, сталь и титановые сплавы, а также на стекле) (Gracia et al., 1997 ). Материал устройства был обработан ультразвуком для разрушения скоплений бактерий. Они использовали калибровочную кривую бактериального АТФ по сравнению с КОЕ, чтобы преобразовать количество молей АТФ в количество КОЕ. Была обнаружена линейная зависимость между обнаруженным бактериальным АТФ и количеством бактерий (КОЕ / мл) в интервале между 3.5 × 10 ⁵ КОЕ / мл и 3,5 × 10 ⁹ КОЕ / мл с высокой корреляцией ( r = 0,99). В настоящем исследовании сравнивали анализ АТФ и метод подсчета КОЕ, показывая сильную или умеренную корреляцию на дакроне через 4 часа и слабую корреляцию через 18 часов и без положительных корреляций на ПТФЭ. Наши данные нельзя сравнивать напрямую, поскольку Gracia et al. использовали раствор отделившихся бактерий для стандартной кривой.

Прилипание бактерий к сосудистым трансплантатам

Что касается прикрепления бактерий к сосудистым трансплантатам, было опубликовано исследований in vitro.Все они определяли адгезию бактерий как количество КОЕ, удаленных из материала трансплантата при обработке ультразвуком.

Schmitt et al. использовали 1 см ² квадратов трансплантата ( n = 5/6), погруженных в бактериальную суспензию S. aureus, Escherichia coli и S. epidermidis . Прилипание бактерий зависело от дакрона и меньше всего от трансплантата из ПТФЭ (Schmitt et al., 1986). Это согласуется с нашими выводами из документации SEM (более разрозненные накопленные группы бактерий на PTFE) и было подтверждено анализом АТФ и подсчетом КОЕ.Kuehn et al. использовали ту же модель для оценки предварительной обработки сосудистых протезов антибиотиками с использованием семи трансплантатов на группу. Они смогли показать, что риск инфицирования сосудистого трансплантата был снижен за счет предварительной обработки протезов антибиотиками, в то время как соединение антибиотик / фибрин проявляло эффект замедленного высвобождения антибиотика (Kuehn et al., 2010). В настоящем исследовании мы использовали стандартизированные поверхности сосудистого трансплантата, вырезанные с помощью пробойника для биопсии с определенной площадью, что может быть проще, чем индивидуальное вырезание небольших совпадающих квадратов.

Sasaki исследовал проникновение бактерий Pseudomonas aeruginosa с внешней поверхности материала сосудистых трансплантатов, сравнивая обработку поверхности трансплантата, запечатанной эластомером и покрытой желатином. В экспериментальной установке 12 или 18 трансплантатов были разрезаны на 6-сантиметровые сегменты, размещены в U-образной конфигурации на культуральных чашках и засеяны на внешней поверхности трансплантата. Данные выявили бактериальную инвазию через материал протезного трансплантата через 6 часов после бактериального погружения без существенных различий между двумя разными способами обработки внешней полиэфирной поверхности (Sasaki, 2014).

Примечательно, что размер группы составлял 5, 6 или 7 человек, и эксперименты проводились только один раз. Это может быть связано с тем, что определение бактериальной адгезии с помощью КОЕ является трудоемким и трудоемким процессом.

Для анализа КОЕ требуется инкубация разбавленного образца бактерий. Обязательной предпосылкой для разведения является растворение бактериальной биопленки, что может быть явным отклонением от различных доступных методов.

Несколько исследователей сообщили о противоречивых результатах в отношении развития резистентных к инфекции сосудистых трансплантатов.Кроме того, были исследованы многочисленные антибиотики, иногда с разными носителями, чтобы стимулировать длительный противомикробный эффект (Kuehn et al., 2010).

Заключение

Модель in vitro может быть использована для воспроизводимой количественной оценки адгезии биопленок на стандартизованных поверхностях сосудистых трансплантатов с анализом АТФ в качестве системы обнаружения. По сравнению с анализом КОЕ, анализ АТФ позволяет ускорить количественное определение бактерий, однако корреляция с анализом КОЕ может зависеть от штамма и поверхности.

Авторские взносы

MH и EAI: разработали этот проект; MH, TB, DK, KB, NO, GT и EAI: участвовали в экспериментах, анализе и интерпретации работы; MH: подготовил рукопись; MH, TB, DK, KB, NO, GT и EAI: проверили рукопись на предмет интеллектуального содержания.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Работа поддержана фондом « Innovative Medical Research» Медицинской школы Университета Мюнстера (ID 111317). Мы благодарим Дамаянти Кайзера из Института медицинской микробиологии за отличную техническую поддержку и Ульрике Келлер и Харальда Нюссе из Института медицинской физики и биофизики Мюнстерского университета за анализ SEM. Материал для сосудистого трансплантата был предоставлен B. Braun, Melsungen, Германия (Uni-Graft ^® K DV) и Vascutek, Terumo, Франкфурт, Германия (PTFE MAXIFLO ™ Ultrathin).

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles//10.3389/fmicb.2017.02333/full#supplementary-material

Таблица S1 . Коэффициент корреляции Пирсона и коэффициент детерминации количественной оценки для всех анализов, поверхностей и временных точек.

Сокращения

АТФ, концентрация митохондриального АТФ как показатель жизнеспособности бактерий; БЭБ-029, БЭБ-295, Ш2000, биопленка S.изоляты aureus ; КОЕ, колониеобразующие единицы; CV, коэффициент изменчивости; Крик, окрашивание кристально-фиолетовым; EPS, матрица внеклеточного полимерного вещества; МТТ, 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид для оценки метаболической активности клеток; ПТФЭ, политетрафторэтилен; R ² , коэффициент детерминации; r , коэффициент корреляции Пирсона; СЭМ, сканирующая электронная микроскопия; SYTO9, окраска нуклеиновых кислот, проникающих в клетки; ВГИ, инфекции сосудистого трансплантата.

Список литературы

Alt, V., Bechert, T., Steinrucke, P., Wagener, M., Seidel, P., Dingeldein, E., et al. (2004). In vitro Тестирование антимикробной активности костного цемента. Антимикробный. Агенты Chemother. 48, 4084–4088. DOI: 10.1128 / AAC.48.11.4084-4088.2004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Becker, K., Pagnier, I., Schuhen, B., Wenzelburger, F., Friedrich, A. W., Kipp, F., et al. (2006). Достаточно ли часто происходит соколонизация носа метициллин-резистентными коагулазонегативными стафилококками и метициллин-чувствительными штаммами Staphylococcus aureus , чтобы представлять риск ложноположительных метициллин-резистентных S.aureus молекулярными методами? J. Clin. Microbiol. 44, 229–231. DOI: 10.1128 / JCM.44.1.229-231.2006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bisdas, T., Beckmann, E., Marsch, G., Burgwitz, K., Wilhelmi, M., Kuehn, C., et al. (2012). Профилактика инфекций трансплантата сосудов с помощью пропитки трансплантата антибиотиком перед имплантацией: in vitro сравнение даптомицина, рифампицина и небацетина. евро. J. Vasc.Эндоваск. Surg. 43, 448–456. DOI: 10.1016 / j.ejvs.2011.12.029

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chaufour, X., Gaudric, J., Goueffic, Y., Khodja, R.H., Feugier, P., Malikov, S., et al. (2017). Многоцентровый опыт эксплантации инфицированного эндотрансплантата брюшной аорты. J. Vasc. Surg. 65, 372–380. DOI: 10.1016 / j.jvs.2016.07.126

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грасиа, Э., Фернандес, А., Кончелло, П., Алабарт, Дж. Л., Перес, М., и Аморена, Б. (1999). Разработка in vitro биопленок Staphylococcus aureus с использованием продуцирующих слизь вариантов и АТФ-биолюминесценции для автоматического определения количества бактерий. Люминесценция 14, 23–31. DOI: 10.1002 / (SICI) 1522-7243 (199901/02) 14: 1 <23 :: AID-BIO513> 3.0.CO; 2-M

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грасиа, Э., Фернандес, А., Кончелло, П., Лаклерига, А., Паниагуа, Л., Seral, F., et al. (1997). Привязка вариантов слизистых штаммов Staphylococcus aureus к биоматериалам, используемым в ортопедической хирургии. Внутр. Ортоп. 21, 46–51. DOI: 10.1007 / s002640050116

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хатцингер, П. Б., Палмер, П., Смит, Р. Л., Пенарриета, К. Т., и Йошинари, Т. (2003). Применимость солей тетразолия для измерения дыхательной активности и жизнеспособности бактерий подземных вод. Дж.Microbiol. Методы 52, 47–58. DOI: 10.1016 / S0167-7012 (02) 00132-X

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хепп, В. (2009). «Послеоперационная инфекция», в Gefäßchirurgie , ред. W. Hepp and H. Kogel (München; Jena: Urban & Fischer Verlag / Elsevier GmbH), 669–683.

Хертен, М., Иделевич, Э.А., Зилькер, С., Беккер, К., Шерзингер, А.С., Осада, Н. и др. (2017). Пропитка сосудистого трансплантата антибиотиками: влияние высоких концентраций рифампицина, ванкомицина, даптомицина и бактериофага эндолизина HY-133 на жизнеспособность сосудистых клеток. Med. Sci. Монит. Basic Res. 23, 250–257. DOI: 10.12659 / MSMBR.9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ickert, I., Herten, M., Vogl, M., Ziskoven, C., Zilkens, C., Krauspe, R., et al. (2015). Опиоиды как альтернатива местным анестетикам амидного типа для внутрисуставного применения. Коленная хирургия. Sports Traumatol. Arthrosc. 23, 2674–2681. DOI: 10.1007 / s00167-014-2989-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Иделевич, Э.A., Schaumburg, F., Knaack, D., Scherzinger, A. S., Mutter, W., Peters, G., et al. (2016). Рекомбинантный бактериофаг эндолизин HY-133 проявляет активность in vitro против различных африканских клональных линий комплекса Staphylococcus aureus , включая Staphylococcus schweitzeri . Антимикробный. Агенты Chemother. 60, 2551–2553. DOI: 10.1128 / AAC.02859-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Иделевич, Э.A., Von Eiff, C., Friedrich, A. W., Iannelli, D., Xia, G., Peters, G., et al. (2011). In vitro активность против Staphylococcus aureus нового противомикробного агента, PRF-119, рекомбинантного химерного эндолизина бактериофага. Антимикробный. Агенты Chemother. 55, 4416–4419. DOI: 10.1128 / AAC.00217-11

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Капур Р. и Ядав Дж. С. (2010). Разработка экспресс-теста биолюминесценции АТФ для определения биоцидной чувствительности быстрорастущих микобактерий. J. Clin. Microbiol. 48, 3725–3728. DOI: 10.1128 / JCM.01482-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Килинг, В. Б., Майерс, А. Р., Стоун, П. А., Хеллер, Л., Виден, Р., Бэк, М. Р. и др. (2009). Региональная доставка антибиотиков для лечения экспериментальных инфекций протезных трансплантатов. J. Surg. Res. 157, 223–226. DOI: 10.1016 / j.jss.2008.06.050

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Куэн, К., Graf, K., Mashaqi, B., Pichlmaier, M., Heuer, W., Hilfiker, A., et al. (2010). Профилактика ранней инфекции сосудистого трансплантата с помощью регионарного высвобождения антибиотиков. J. Surg. Res. 164, e185 – e191. DOI: 10.1016 / j.jss.2010.05.029

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Палестрант Д., Хольцнехт З. Э., Коллинз Б. Х., Паркер В., Миллер С. Э. и Боллинджер Р. Р. (2004). Микробные биопленки в кишечнике: визуализация с помощью электронной микроскопии и окрашивания акридиновым оранжевым. Ultrastruct. Патол. 28, 23–27. DOI: 10.1080 / 0104196

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Паттерсон, Дж. Л., Сталл-Лейн, А., Гирер, П. Х. и Джефферсон, К. К. (2010). Анализ адгезии, образования биопленок и цитотоксичности предполагает более высокий потенциал вирулентности Gardnerella vaginalis по сравнению с другими анаэробами, связанными с бактериальным вагинозом. Микробиология 156, 392–399. DOI: 10.1099 / mic.0.034280-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Петерс, Э., Нелис, Х. Дж., И Коэнье, Т. (2008). Сравнение нескольких методов количественной оценки микробных биопленок, выращенных в микротитровальных планшетах. J. Microbiol. Методы 72, 157–165. DOI: 10.1016 / j.mimet.2007.11.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Петтит Р.К., Вебер К.А. и Петтит Г.Р. (2009). Применение высокопроизводительного анализа чувствительности биопленок Alamar blue к Staphylococcus aureus биопленкам. Ann. Clin. Microbiol.Противомикробный. 8:28. DOI: 10.1186 / 1476-0711-8-28

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Питтс Б., Гамильтон М. А., Зельвер Н. и Стюарт П. С. (2003). Метод скрининга микротитрационных планшетов для дезинфекции и удаления биопленок. J. Microbiol. Методы 54, 269–276. DOI: 10.1016 / S0167-7012 (03) 00034-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ромлинг, У., Кьеллеберг, С., Нормарк, С., Найман, Л., Улин, Б.Э., и Акерлунд, Б. (2014). Образование микробной биопленки: необходимость действовать. J. Intern. Med. 276, 98–110. DOI: 10.1111 / joim.12242

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Sanz, M., Beighton, D., Curtis, M.A., Cury, J.A., Dige, I., Dommisch, H., et al. (2017). Роль микробных биопленок в поддержании здоровья полости рта и в развитии кариеса зубов и заболеваний пародонта. Консенсус-отчет группы 1 совместного семинара EFP / ORCA о границах между кариесом и пародонтозом. J. Clin. Пародонтол. 44 (Дополнение 18), S5 – S11. DOI: 10.1111 / jcpe.12682

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сасаки Ю. (2014). in vitro исследование бактериальной инвазии протезных сосудистых трансплантатов: сравнение дакроновых сосудистых трансплантатов с эластомерным уплотнением и желатиновым покрытием. Surg. Сегодня 44, 1542–1547. DOI: 10.1007 / s00595-013-0761-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шмитт, Д.Д., Бандык Д. Ф., Пекет А. Дж. И Таун Дж. Б. (1986). Бактериальное прилегание к сосудистым протезам. Детерминант инфекционности трансплантата. J. Vasc. Surg. 3, 732–740. DOI: 10.1016 / 0741-5214 (86) -6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Степанович, С., Вукович, Д., Дакич, И., Савич, Б., и Свабич-Влахович, М. (2000). Модифицированный тест на микротитрационном планшете для количественной оценки образования стафилококковой биопленки. J. Microbiol. Методы 40, 175–179.DOI: 10.1016 / S0167-7012 (00) 00122-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Таваколи, П. Н., Аль-Ахмад, А., Хот-Ханниг, В., Ханниг, М., и Ханниг, К. (2013). Сравнение различных окрашиваний живых / мертвых для обнаружения и количественной оценки прикрепившихся микроорганизмов в исходной биопленке полости рта. Clin. Устное расследование. 17, 841–850. DOI: 10.1007 / s00784-012-0792-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Злодей-Гийо, П., Гуалтьери, М., Бастид, Л., и Леонетти, Дж. П. (2007). In vitro активности различных ингибиторов бактериальной транскрипции против биопленки Staphylococcus epidermidis . Антимикробный. Агенты Chemother. 51, 3117–3121. DOI: 10.1128 / AAC.00343-07

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Антибиотики — Типы антибиотиков

Профилактика осложнений от антибиотиков

Антибиотики выводятся почками или выводятся печенью, а затем выводятся почками.Из-за этого некоторые антибиотики следует с осторожностью назначать пациентам с заболеваниями почек, печени или и тем, и другим. Чтобы предотвратить слишком низкую или, что более вероятно, слишком высокую концентрацию антибиотиков, которая может привести к серьезным побочным эффектам, у этих людей необходимо изменить режим дозирования.

Профилактика анафилаксии

Тем, кто в прошлом испытывал аллергическую реакцию на конкретный антибиотик (который интуитивно мог бы включать других членов его семейства антибиотиков), никогда не следует снова подвергаться воздействию этого семейства антибиотиков.Такое повторное воздействие на иммунную систему, «заряженную и готовую», может привести к опасному для жизни анафилактическому шоку. Исключением является терапия пенициллином у беременных, больных сифилисом, при которой альтернативы не проникают через плаценту для лечения одновременной инфекции ребенка; в этих случаях аллерголог может провести процедуру десенсибилизации, до которой можно будет безопасно назначать пенициллин для лечения как ребенка, так и матери.

Профилактические антибиотики

Те, у кого в анамнезе была ревматическая лихорадка и / или порок клапанов сердца, могут страдать от колонизации своих клапанов, если бактерии попадают в кровоток с помощью инвазивных процедур, таких как хирургия, стоматологическая работа или инвазивное тестирование (биопсия и т. Д.)). Этим пациентам перед проведением таких процедур будут назначены антибиотики, чтобы при теоретическом посеве был уровень крови на борту.

Аналогичным образом, профилактические антибиотики используются с постоянными катетерами, которые имеют высокий риск инфицирования с течением времени, такими как катетеры мочевого пузыря Фолея, порты для перитонеального диализа или центральные линии.

Перед установкой гастростомических трубок или при операциях с участием пациентов с низким содержанием лейкоцитов или иммуносупрессивных препаратов показаны профилактические антибиотики.

Операции, которые связаны с воздействием «загрязненной» среды на «чистую» среду, должны иметь антибиотикопрофилактику, которая охватывает обычные бактерии, которые обычно обитают в нестерильных областях. Примером может служить вагинальная гистерэктомия, при которой стерильная брюшная полость разрывается для удаления матки через влагалище. Другой пример — операция на толстой кишке, которая включает проникновение в просвет кишечника, через который кишечные бактерии попадают в брюшную полость. Некоторые считают, что любая операция, которая включает разрез кожи для входа в брюшную полость, грудную клетку или череп, является таким «чистым зараженным» случаем.

Эмпирическая антибиотикопрофилактика подходит в индивидуальных ситуациях, специфичных для пациента. Например, если мужчина лечится от инфекции, передаваемой половым путем (ИППП), его половой партнер должен лечиться одновременно с этим из-за вероятности заражения, даже если нет никаких симптомов. Профилактика рецидива ИППП основана на культуре и чувствительности после полного курса антибиотиков, что называется «тестом на излечение» (TOC).

Материал для сосудистого трансплантата из полиэстера и риск внутриполостной инфекции грудного сосудистого трансплантата — Том 26, номер 10 — октябрь 2020 г. — Журнал Emerging Infectious Diseases

Сведения об авторах: Университетская клиника Цюриха, Цюрих, Швейцария (Т.А. Швейцер, С. Маирпади Шамбат, В. Денглер Хаунрейтер, К.А. Местрес, Ф. Майзано, А.С. Цинкернагель, Б. Хассе); HerzZentrum Hirslanden Zurich, Цюрих (А. Вебер)

Инфекции протезного сосудистого трансплантата (PVGI) грудной аорты встречаются у 1–3% пациентов, но летальность составляет> 20% ( 1 , 2 ). Из-за старения населения с множественными заболеваниями имплантируется больше сосудистых трансплантатов, что приводит к увеличению числа ПВГИ. Инфекция часто возникает в периоперационном периоде ( 3 ) в результате заражения бактериями, происходящими в основном из собственной кожной флоры пациента.PVGI — это инфекции, связанные с биопленками, при которых матрикс вокруг бактерий снижает шансы на успех лечения ( 4 ). Следовательно, основная цель — предотвратить периоперационные инфекции путем выявления факторов риска, таких как тип протеза.

Немногочисленные сравнительные исследования, о которых сообщалось, были в основном сосредоточены на использовании трансплантатов с антибиотиками для снижения риска развития PVGI in vitro и in vivo ( 5 — 7 ). Однако следует учитывать отсутствие одобрения регулирующих органов, ограниченную коммерческую доступность и отсутствие данных долгосрочного наблюдения по выживаемости без инфекции ( 8 — 10 ).Кроме того, давление отбора из-за использования местных антибиотиков может привести к резистентности. Staphylococcus aureus , как было показано, колонизирует связанные с рифампицином трансплантаты через 7 дней после имплантации ( 10 ). Следовательно, имплантированные трансплантаты обычно покрываются только белковыми растворами, что обеспечивает быструю интеграцию в ткань хозяина. Мы сравнили восприимчивость 2 трансплантатов к образованию биопленок in vitro и частоту инфекций in vivo.

Для нашего исследования in vitro мы сравнили восприимчивость двух тканых трансплантатов из полиэфирных волокон грудных сосудов с различным покрытием — коллагеном (коллагеновый трансплантат, InterGard Hemabridge, https: // www.getinge.com) и желатин (желатиновый трансплантат, Terumo Aortic, Gelweave, https://terumoaortic.com) — для образования биопленок. Коллагеновый трансплантат покрыт высокоочищенной формой сшитого бычьего коллагена 1 типа. Трансплантат желатина покрыт модифицированным желатином млекопитающего. Желатин получают в основном из коллагена типа 1 путем тепловой денатурации, процесса, во время которого коллаген теряет свою природную тройную спиральную структуру. Время резорбции коллагена составляет 4–8 недель, желатина — 14 дней. Для нашего исследования in vivo мы исследовали частоту инфекций, связанных с двумя трансплантатами, среди потенциальных пациентов, перенесших операцию на открытом грудной клетке в Университетской клинике Цюриха (Цюрих, Швейцария).

Рисунок

Рисунок. Повышенная восприимчивость коллагенового трансплантата к образованию биопленки по сравнению с желатиновым трансплантатом. Пластыри трансплантата инокулировали указанными штаммами бактерий в течение 72 часов и анализировали количественно и качественно. А) Формирование биопленки …

Для экспериментов in vitro мы разрезали трансплантаты на квадратные кусочки 5 × 5 мм и инокулировали их бактериальными штаммами, представляющими патогены, участвующие в грудном PVGI в нашей когорте пациентов. Они были получены либо у пациентов с когортным исследованием сосудистого трансплантата (VASGRA), либо у лабораторных штаммов (таблица 1 приложения, рисунок 1) и сохранены на чашках с кровяным агаром Columbia (bioMérieux SA, https: // www.biomerieux.com) и в триптическом соевом бульоне (Becton Dickinson, https://www.bd.com) при 37 ° C. Пластыри трансплантата инкубировали с бактериями в растворе трипсина соевого бульона и глюкозы (концентрация глюкозы 8 ммоль / л) при 37 ° C в течение 72 часов, среду меняли каждые 24 часа. Пластыри промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), обрабатывали ультразвуком при 44 кГц, и полученную оптическую плотность при длине волны 600 измеряли на считывающем устройстве для микропланшетов. Все бактерии, за исключением штамма 2 Pseudomonas aeruginosa , показали повышенное образование биопленок на коллагеновом трансплантате по сравнению с участками желатинового трансплантата (рисунок, панель A).

Биопленки выбранных штаммов окрашивали SYTO 9 из набора LIVE / DEAD Bac Light Bacterial Viability Kit (ThermoFisher Scientific, https://www.thermofisher.com) в соответствии с инструкциями производителя. Пластыри трансплантата помещали на 8-луночные микроскопы (там же, https://ibidi.com) и визуализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с помощью инвертированного микроскопа Leica TCS SP8 (https://www.leica-microsystems.com) под микроскопом. Маслоиммерсионный объектив 63 × / 1,4. Мы выбрали 2 репрезентативных пятна на каждый участок трансплантата, обеспечивая стопку изображений, полученных по горизонтали (512 × 512 пикселей, представляющих площадь 244.8 мкм × 244,8 мкм) с размером шага по оси Z 0,12 мкм. Мы обработали полученные стеки с помощью программного обеспечения Imaris 9.2.0 (Bitplane; Oxford Instruments, https://imaris.oxinst.com/support/imaris-release-notes/9-2-0). Высота и объем биопленки определялись, как описано ранее ( 11 ). Этот подход проиллюстрировал повышенное образование биопленки на участках трансплантата коллагена (рис. 2 в приложении). Количественный анализ полученных изображений конфокальной лазерной сканирующей микроскопии подтвердил первоначальные результаты, поскольку биопленка, выращенная на участках трансплантата коллагена, показывала увеличенный общий объем биопленки, а также максимальную высоту биопленки (рисунок, панель B).

Одним из возможных объяснений повышенной восприимчивости к образованию биопленок может быть отчетливое покрытие трансплантатов. Следовательно, мы покрывали лунки планшетов на ночь при 4 ° C либо коллагеном 1 из хвоста крысы (10 мкг / мл; ThermoFisher Scientific), либо раствором желатина типа B (10 мкг / мл; Sigma-Aldrich, https://www.sigmaaldrich.com ). Планшеты инкубировали с бактериями при 37 ° C в течение 30 мин. Бактерии промывали, окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым (Fluka; Sigma Aldrich, https: //www.sigmaaldrich.com), солюбилизированный в 95% этаноле, и измеряли полученную оптическую плотность при 570 нм. Тестируемые штаммы значительно лучше прилипали к коллагену (рисунок, панель C). Наши результаты подтверждаются исследованиями, демонстрирующими способность грамположительных бактерий прикрепляться к коллагену, тогда как для желатина наблюдалась лишь незначительная аффинность ( 12 , 13 ).

Чтобы оценить влияние этих результатов in vivo, мы проанализировали 412 потенциальных участников с ткаными трансплантатами из полиэстера: 28 участников VASGRA, у которых развился внутриполостный грудной PVGI, и 384 пациента, перенесших одновременную операцию на открытом сердце, у которых PVGI не развился (контрольная группа) (таблица ).Данные и штаммы, выделенные от пациентов, были использованы в соответствии с утверждением Кантонального этического комитета KEK-ZH-Nr. 2012-0583. Для статистического анализа с помощью GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, https://www.graphpad.com) мы использовали непараметрические тесты (точное определение Фишера или сумма рангов Вилкоксона, в зависимости от ситуации). При нормализации к общему количеству контрольных пациентов (n = 384, которые перенесли кардиохирургию, но не имели PVGI), расчетный процент внутриполостного грудного PVGI (n = 28 пациентов VASGRA, перенесших кардиохирургию и перенесших PVGI) был выше. для пациентов с коллагеновым трансплантатом (10.8%) по сравнению с группой, получавшей желатиновый трансплантат (3,52%; p <0,005).

Мы обнаружили большее образование биопленки на сосудистых трансплантатах из полиэфира, покрытых коллагеном, чем на трансплантатах, покрытых желатином, возможно, потому, что тестируемые штаммы значительно лучше прилипали к коллагену, чем к желатину. Когда мы проанализировали потенциальных пациентов с PVGI и современную контрольную группу, процент PVGI, связанный с трансплантатами, покрытыми коллагеном, также был выше.

Сильные стороны нашего исследования включают использование штаммов бактерий, полученных от пациентов, и перспективный сбор пациентов с инцидентными PVGI и контрольной группой.Наше исследование имеет некоторые ограничения. Во-первых, это было одноцентровое исследование, что привело к небольшому количеству пациентов, а роль материала трансплантата как фактора риска PVGI трудно доказать из-за редкости инфекции. Кроме того, данные для пациентов с PVGI следует интерпретировать с осторожностью, потому что у некоторых пациентов есть дополнительный инородный материал в сердце. Во-вторых, отсутствует общедоступная информация о точном типе покрытия, а также об используемых процедурах нанесения. Кроме того, эксперименты проводились на статической экспериментальной установке вместо проточной камеры.Однако, поскольку мы были заинтересованы в прямом прикреплении бактерий к материалу трансплантата, моделируя сценарий, при котором инфекция могла бы возникнуть в результате непреднамеренной инокуляции во время периоперационного периода, мы считаем, что использованная установка является адекватной. Мы не воспроизводили эксперимент по образованию грамположительной и грамотрицательной смешанной биопленки, потому что мономикробная установка позволила нам определить, какой материал и покрытие были более восприимчивыми к прилипанию бактерий, более контролируемым образом.

В заключение, образование биопленок было увеличено на покрытых коллагеном сосудистых трансплантатах по сравнению с трансплантатами, покрытыми желатином in vitro. В отличие от другого анализа факторов риска из исследования VASGRA ( 3 ), в нашем исследовании материал трансплантата был связан с частотой PVGI. Такие параметры, как потенциал васкуляризации, безопасный рост псевдоинтимы и сниженная тромбогенность, воспринимаются как влияющие на успешную интеграцию и функциональность протезных сосудистых трансплантатов ( 14 ).При проектировании и разработке сосудистых протезов следует учитывать дополнительные параметры, чтобы уменьшить возникающую тенденцию к PVGI.

Г-н Швейцер — аспирант отделения инфекционных болезней и госпитальной эпидемиологии университетской больницы Цюриха. Его основные исследовательские интересы включают бактериальные и грибковые хронические инфекции, а также возникающие в результате взаимодействия хозяин-патоген.

верхний

Мы благодарны нашим пациентам за участие в исследовании.Мы благодарим медицинских сестер-исследователей Кэролайн Мюллер и Симону Бюргин, а также Кристин Лаич и Кристин Фогтли за административную помощь.

Конфокальная визуализация была выполнена при поддержке Центра микроскопии и анализа изображений Цюрихского университета. Данные, включенные в эту публикацию, являются частью магистерской диссертации на факультете естественных наук Цюрихского университета (T.A.S.).

Исследование финансировалось в рамках VASGRA при поддержке гранта Швейцарского национального научного фонда 320030_184918 / 1 (Б.H.) и 31003A_176252 (к A.S.Z.). Эта работа также была поддержана Программой приоритетных клинических исследований Цюрихского университета для Программы приоритетных клинических исследований «Точная медицина при бактериальных инфекциях». Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

B.H. и A.S.Z. разработал исследование. T.A.S. и С.М.С. провел эксперименты, проанализировал данные и написал первый черновик. Все авторы участвовали в сборе и интерпретации данных, рецензировали черновики рукописи, написали окончательную версию рукописи и одобрили окончательную рукопись.

Выводы, выводы и мнения, выраженные авторами, работающими в этом журнале, не обязательно отражают официальную позицию Министерства здравоохранения и социальных служб США, Службы общественного здравоохранения, Центров по контролю и профилактике заболеваний или аффилированных с авторами учреждения. Торговые наименования используются только для идентификации и не подразумевают одобрения какой-либо из вышеперечисленных групп.

Некротический фасциит (плотоядные бактерии): причины, симптомы и лечение

Что такое плотоядные бактерии (некротический фасциит)?

Плотоядные бактерии (некротический фасциит) — редкая инфекция кожи и тканей под ней.Это может быть смертельно опасным, если не лечить быстро.

Некротический фасциит быстро и агрессивно распространяется у инфицированного человека. Это вызывает гибель тканей в очаге инфекции и за ее пределами.

Ежегодно в США диагностируется от 600 до 700 случаев заболевания. Примерно от 25% до 30% этих случаев заканчиваются смертью. Это редко случается у детей.

Причины и факторы риска плотоядных бактерий

Некротический фасциит обычно вызывается бактериями стрептококка группы А (ГАЗ).Это тот же тип бактерий, который вызывает фарингит. Но несколько типов бактерий, таких как стафилококк и другие, также связаны с заболеванием.

Некротический фасциит возникает, когда эти типы бактерий поражают поверхностную фасцию, слой соединительной ткани под кожей.

Передача плотоядных бактерий

Бактерии, вызывающие некротический фасциит, могут проникать в организм через:

В некоторых случаях неизвестно, как началась инфекция.Как только это происходит, инфекция быстро разрушает мышцы, кожу и жировую ткань.

Ослабленная иммунная система и некоторые заболевания могут повысить вероятность заражения плотоядными бактериями (некротический фасциит). Состояние здоровья, которое может повысить ваш риск, включает:

Плотноедные бактерии Симптомы

Ранние симптомы заражения плотоядными бактериями обычно появляются в течение первых 24 часов после заражения. Симптомы аналогичны другим состояниям, таким как грипп или менее серьезная кожная инфекция.Ранние симптомы также похожи на распространенные послеоперационные жалобы, такие как:

Симптомы часто включают комбинацию следующего:

• Усиливающаяся боль в общей области небольшого пореза, ссадины или другого кожного отверстия.
• Боль сильнее, чем можно было бы ожидать от пореза или ссадины.
• Покраснение и тепло вокруг раны, хотя симптомы могут начаться на других участках тела.
• Гриппоподобные симптомы, такие как диарея, тошнота, лихорадка, головокружение, слабость и общее недомогание.
• Сильная жажда из-за обезвоживания.

Более сложные симптомы появляются вокруг болезненного места инфекции в течение 3-4 дней после заражения. К ним относятся:

• Отек, возможно, вместе с лиловой сыпью
• Большие пятна фиолетового цвета, которые превращаются в волдыри, наполненные темной дурно пахнущей жидкостью
• Обесцвечивание, шелушение и шелушение по мере отмирания тканей (гангрены)

Критические симптомы, которые часто возникают в течение 4–5 дней после заражения, включают:

Диагностика плотоядных бактерий

Плотноедные бактерии (некротический фасциит) быстро поражают организм, поэтому ранняя диагностика важна для выживания.

Врач осмотрит вас и изучит ваши симптомы. Наличие плотоядных бактерий требует неотложной медицинской помощи, и если врач подозревает, что они у вас есть, вас, скорее всего, доставят в больницу и там сдадут анализы.

Тесты для диагностики плотоядных бактерий (некротический фасциит) включают:

Анализы крови. Люди с плотоядными бактериями имеют высокий уровень лейкоцитов.

Биопсия ткани. Вам может потребоваться диагностическая операция для удаления части ткани из инфицированной области.Ткань отправляется в лабораторию для определения конкретных бактерий, вызывающих инфекцию. Но вам дадут лекарство от инфекции до того, как вернутся результаты анализов.

Компьютерная томография. Компьютерная томография может показать вашему врачу, где в организме скапливаются жидкость и гной. Он также показывает наличие пузырьков газа под кожей, что помогает подтвердить диагноз.

Члены семьи и другие лица, имевшие тесный контакт с больным некротическим фасциитом, должны быть проверены на это заболевание, если у них есть симптомы инфекции.

Лечение плотоядных бактерий

Пациенты, инфицированные плотоядными бактериями, будут проходить несколько видов лечения. Объем лечения зависит от стадии заболевания, когда оно начато. В курс лечения входят:

• Внутривенная антибактериальная терапия.
• Операция по удалению поврежденных или мертвых тканей, чтобы остановить распространение инфекции.
• Лекарства для повышения артериального давления.
• В некоторых случаях ампутации пораженных конечностей.
• Гипербарическая оксигенотерапия может быть рекомендована для сохранения здоровых тканей.
• Сердечные и дыхательные аппараты.
• Переливания крови.
• Иммуноглобулин для внутривенного введения. Это поддерживает способность организма бороться с инфекцией.

Осложнения, связанные с питательными бактериями

Серьезные осложнения являются обычными и могут включать:

• Сепсис
• Шок
• Органная недостаточность
• Потеря руки или ноги в результате ампутации 98
• Тяжелое рубцевание 9401298
• Профилактика плотоядных бактерий

  Мытье рук с мылом или использование дезинфицирующего средства для рук на спиртовой основе — один из лучших шагов, которые вы можете предпринять для предотвращения плотоядных бактерий и других кожных инфекций.

  • Вы также можете предотвратить кожные инфекции, выполнив следующие действия:
  • Всегда промывайте порезы и открытые раны водой с мылом.
  • После очистки закройте мокнущую, дренирующую или открытую рану чистой сухой повязкой.
  • Обратитесь к врачу, если у вас серьезная или глубокая рана, например, прокол или огнестрельное оружие.
  • Не ходите плавать и не пользуйтесь гидромассажной ванной, если у вас открытая рана или кожная инфекция.

  Не существует вакцины для предотвращения заражения плотоядными бактериями.

  Перспективы поедающим плоть бактериям

  Ранняя диагностика и быстрое агрессивное лечение имеют решающее значение, когда дело доходит до борьбы с этой редкой кожной инфекцией. Многим людям требуется более одной процедуры для удаления поврежденной инфицированной ткани. Если у вас красная опухшая кожа, которая не проходит, запишитесь на прием к врачу.

  Чувствительность сосудистых трансплантатов ePTFE и биоинженерных бесклеточных сосудов человека к инфекции

  https://doi.org/10.1016/j.jss.2017.08.035Получить права и содержание

  Реферат

  Предпосылки

  Синтетические расширенные трансплантаты политетрафторэтилена (ePTFE) являются обычно используется для восстановления и реконструкции сосудов, но подвержен устойчивым бактериальным инфекциям.Исследованные биоинженерные бесклеточные сосуды человека (ВГА) показали клинический успех и могут снизить восприимчивость к инфекции. Здесь мы напрямую сравнили восприимчивость трансплантатов ePTFE и HAV к бактериальному заражению на доклинической модели инфекции.

  Материалы и методы

  Срезы (1 см ² ) ePTFE ( n = 42) или HAV ( n = 42) вводили в двусторонние подкожные карманы на спине крыс и инокулировали Staphylococcus aureus (10 ⁷ КОЕ / 0.25 мл) или Escherichia coli (10 ⁸ КОЕ / 0,25 мл) до закрытия раны. Две недели спустя места имплантатов были оценены на предмет образования абсцесса, а эксплантированный материал был уменьшен вдвое для количественной оценки микробного восстановления и гистологического анализа.

  Результаты

  Имплантаты из ePTFE имели значительно более высокие показатели образования абсцесса для прививок S. aureus и E. coli по сравнению с прививками HAV. Кроме того, из эксплантированного ePTFE было извлечено значительно больше бактерий по сравнению с HAV.Окрашивание по Граму эксплантированных срезов ткани выявило интерстициальную бактериальную контаминацию внутри ePTFE, тогда как в срезах ткани HAV бактерии не были идентифицированы. Многочисленные лейкоциты CD45 ⁺ , преимущественно нейтрофилы, были обнаружены вокруг имплантатов ePTFE, но минимальное количество интактных нейтрофилов было обнаружено в матрице ePTFE. Клетки-хозяева, окружающие эксплантаты HAV и инфильтрирующие их, были в основном нелейкоцитами (CD45 ^— ).

  Выводы

  В установленной модели инфекции на животных ВГА был значительно менее подвержен бактериальной колонизации и образованию абсцесса, чем ePTFE.Доклинические данные, представленные в этой рукописи, в сочетании с ранее опубликованными клиническими наблюдениями предполагают, что биоинженерный HAV может демонстрировать низкие показатели инфицирования.

  No related posts.